Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Stanhope-Baker P., Hudson KM., Shaffer A.L., Constantinescu A., and Schlissel M.S., 1996. Cell type-specific chromatin structure determines the targeting of V(D)J recombinase activity in vitro. Cell 85: 887–897.

Su I.H., Basavaraj A., KrutchinskyA.N., Hobert O., Ullrich A., Chait B.T., and Tarakhovsky A., 2003. Ezh2 controls B cell development through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4: 124–131.

Su I.H., Dobenecker M.W., Dickinson E., Osier M., Basavaraj A., Marqueron R., Viale A., Reinberg D., Wiilfing C., and Tarakhovsky A., 2005. Polycomb group protein Ezh2 controls actin polymerization and cell signaling. Cell 121: 425–436.

Tachibana M., Sugimoto K., Nozaki M., Ueda J., Ohta T., Ohki M., Fukuda M., Takeda N., Niida H., Kato H., and Shinkai Y., 2002. G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3 lysine 9 methylation and is essential for early embryogenesis. Genes Dev. 16: 1779–1791.

Turner C.A.J., Mack D.H., and Davis M.M., 1994. Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells. Cell 77: 297–306.

Vosshenrich C.A.J., Cumano A., Muller W., Di Santo J.P., and Vieira P., 2003. Thymic stroma-derived lymphopoietin distinguishes fetal from adult B cell development. Nat. Immunol. 4: 773–779.

Waskow C, Paul S., Haller C, Gassmann M., and Rodewald H., 2002. Viable c-Kitw/w mutants reveal pivotal role for c-Kit in the maintenance of lymphopoiesis. Immunity 17: 277–288.

West K.L., Singha N.C., De Ioannes P., Lacomis L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., and Cortes P., 2005. A direct interaction between the RAG2 C terminus and the core histones is required for efficient V(D)J recombination. Immunity 23: 203–212.

Xie H., Ye M., Feng R., and Graf T., 2004. Stepwise reprogramming of B cells into macrophages. Cell 117: 663–676.

Yancopoulos G.D. and Alt F.W., 1985. Developmentally controlled and tissue-specific expression of unrearranged VH gene segments. Cell 40: 271–281.

Ye B.H., Cattoretti C., Shen Q., Zhang J., Hawe N., de Waard R., Leung C., Nouri-Shirazi M., Orazi A., Chaganti R.S.K., et al., 1997. The BCL — 6 proto-oncogene controls germinal-centre formation and Th2-type inflammation. Nature Genet. 16: 161–170.

Zhang S., Fukuda S., Lee Y., Hangoc G., Cooper S., Spolski R., Leonard W.J., and Broxmeyer H.E., 2000. Essential role of signal transducer and activator of transcription (Stat) 5a but not Stat5b for Flt3-dependent signaling. J. Exp. Med., 192: 719–728.

Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома

Rudolf Jaenisch и John Gurdon

Whitehead Institute, and Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02142-1479

The Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, The Henry Wellcome Building of Cancer and Developmental Biology, University of Cambridge, Camebridge CB2 1QN, United Kingdom

Общее резюме

План тела животных сконструирован из сотен разных типов клеток, выполняющих различные физиологические функции организма. Ключевым вопросом, поставленным уже давно, является вопрос о механизме дифференциальной экспрессии генов, который обеспечивает активность или «молчание» генов, нужных для нормального функционирования данной дифференцированной клетки. В прежние дни, до того как удалось оценить молекулярные основы генной экспрессии, гипотетически предполагали, что основой тканеспецифичной экспрессии генов могла бы быть генетическая элиминация или перманентная инактивация «молчащих» генов из тех тканей, которые не экспрессировали «молчащие» гены, и сохранение тех генов, которые экспрессируются. Действительно, у некоторых организмов, таких как насекомое Sciara, генетический материал элиминируется из соматических тканей, и полный генетический набор сохраняется только в клетках зародышевого пути. Это ставит вопрос об «эквивалентности ядер», т. е. о том, сохраняет ли геном соматических клеток полный набор генетического материала. Самым прямым подходом к решению этого вопроса является ядерное клонирование, где возможности ядра соматической донорской клетки направлять развитие нового организма проверяются путем его трансплантации в денуклеированную яйцеклетку. В самом деле, получение клонированных животных из ядер соматических клеток доказало, вне всякого сомнения, что главные генетические изменения, не даюшие соматическому ядру генерировать все клеточные типы, не являются частью нормального процесса развития.

1. История

Первый успех в трансплантации ядра одной клетки в другую у многоклеточного организма был достигнут Бриггсом и Кингом в 1952 году (Briggs and King, 1952), хотя до этого пересадка ядра была сделана у одноклеточных организмов, в том числе у амебы, инфузорий и Acetabularia (Gurdon, 1964). Бриггс и Кинг (Briggs and King, 1952) получили нормальных плавающих головастиков в результате пересадки ядер клеток бластулы в денуклеированное яйцо Ranapipiens. В этой и последующих работах с R. pipiens до 30 % пересадок ядер бластулы давали морфологически нормальные постнейральные стадии. Значение этого раннего достижения заключалось в том, что оно открыло способ протестировать, могут ли ядра дифференцированных клеток также поддерживать нормальное развитие реципиентных яйцеклеток, т. е. замещать зиготическое ядро нормально оплодотворенных яиц. В следующей важной статье Бриггса и Кинга (Briggs and King, 1957) сообщалось, что очень скоро после стадии бластулы ядра соматических клеток (в этом случае эндодермы) утрачивают способность поддерживать нормальное развитие. Действительно, к стадии хвостовой почки ядра эндодермы больше не обеспечивали нормальное развитие.

Вскоре после этого сообщили об успешной пересадке ядер у Xenopus (Fischberget al., 1958). У этого вида для доказательства того, что развитие эмбрионов-трансплантатов обеспечивалось исключительно активностью пересаженного ядра без какого-либо вклада со стороны ядра яйцеклетки, которое было убито ультрафиолетовым облучением, был использован генетический маркер. У Xenopus полученные в результате трансплантации ядер эмбрионы развивались более нормально, чем у Rana, и очень быстро достигали стадии взрослого животного. Первые половозрелые взрослые клонированные животные были получены у Xenopus в результате пересадки ядер эндодермы (Gurdon et al., 1958), и большая их часть выглядела нормальной во всех отношениях.

Чтобы ядерное клонирование оказалось успешным, яйцеклетка должна «репрограммировать» соматическое донорское ядро в «эмбриональное» эпигенетическое состояние, чтобы могла быть активирована генетическая программа, необходимая для эмбрионального развития. Современные исследования сфокусированы в основном на том, чтобы понять молекулярные основы репрограммирования в экспериментах с трансплантацией ядер. Поскольку эмбриональное развитие у амфибий и у млекопитающих очень различается, каждая из этих систем может обеспечить проникновение в разные аспекты проблемы репрограммирования в опытах по трансплантации ядер. Например, благодаря тому, что у амфибий легко можно получить огромное число крупных яиц, эта система особенно полезна для проведения биохимических анализов. Напротив, млекопитающие, в особенности мыши, позволяют применять, в первую очередь, тканевые культуры и генетические подходы. По этим причинам наблюдения, сделанные на амфибиях и на млекопитающих, являются взаимодополняющими и обсуждаются совместно, чтобы подчеркнуть сходства и различия этих двух систем. Прежде всего мы описываем фенотип клонированных амфибий и млекопитающих и как на него влияет состояние дифференцировки донорского ядра. За этим следует описание молекулярных механизмов, признанных важными для репрограммирования. В конце обсуждаются потенциальные возможности трансплантации ядер для терапии.

2. Процедуры пересадки ядер

2.1. Амфибии

Доступность яиц Xenopus на протяжении всего года и легкость содержания этого водного животного в лаборатории обусловили то обстоятельство, что большая часть работ по пересадкам ядер у амфибий, после первоначального успеха с Rana, была предпринята на Xenopus Следует различать два рода экспериментов в соответствии с тем, инъецируются ядра в денуклеированные яйцеклетки или же в неденуклеированные ооциты (рис. 22.1). Пересадка ядра требует инъекции всей донорской клетки, плазматическую мембрану которой предварительно делают проницаемой либо физическими методами, например всасыванием этой клетки в пипетку, слишком маленькую по сравнению с размерами клетки, либо химическими методами, за счет кратковременной обработки интегрирующим мембрану веществом. Количество цитоплазмы донорской клетки, вводимое с ядром, равно приблизительно 10-5 объема яйцеклетки и никакого влияния не оказывает. Яйцеклетки, получившие пересаженное ядро, культивируются в простом непитательном солевом растворе, эквивалентном прудовой воде, и, следовательно, развиваются независимо от культурального раствора.

Пересадка ядер в ооциты выглядит совершенно иначе. Полностью выросшие ооциты, взятые из яичника самки, находятся в профазе первого мейоза (рис. 22.1). Ядра примерно 50 соматических клеток, инъецированные в ядро (зародышевый пузырек) этих растущих ооцитов, не реплицируют ДНК и не делятся, но на протяжении нескольких дней становятся все более активными в отношении транскрипции. Ооциты, получившие пересаженные ядра, культивируются подобно яйцеклеткам в непитательной солевой среде и не претерпевают никаких морфологических изменений на протяжении всего периода культивирования (две недели и больше).

Рис. 22.1. Схема, изображающая два типа экспериментов по трансплантации ядер у Xenopus

^{Верхняя часть рисунка иллюстрирует пересадки одиночных ядер в яйцеклетки, денуклеированные ультрафиолетовым облучением (УФ). Спустя три дня после пересадки ядра формируется плавающий головастик Нижняя часть рисунка показывает множественные пересадки ядер в растущие ооциты на стадии первой мейотической профазы (GV) Зародышевый пузырек, или ядро ооцита. Подвергшиеся инъекции ооциты не делятся и могут культивироваться в течение многих дней. Инъецированные ядра соматических клеток претерпевают изменения в экспрессии генов на протяжении первых четырех дней культивирования}