Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Периферическое пространство ядра и перицентромерный гетерохроматин — это два главных репрессивных компартмента в ядре, которые важны для воспроизведения и для неактивного состояния генов в гематопоэтических клетках (Brown et al., 1997; Baxter et al., 2002). В зависимости от степени своей активности, гены перемещаются между этими репрессивными компартментами и центральными позициями в ядре, что облегчает транскрипцию генов. Интересно, что локусы IgHw Ig? «по умолчанию» расположены на периферии ядра во всех не-В клетках, включая некоммитированные лимфоидные прогениторы (Kosak et al., 2002). Таким образом, локус IgH заякорен через дистальные гены VH на периферии ядра и сориентирован проксимальным доменом IgH по направлению к центру ядра, что облегчает перестройки DH-JH в лимфоидных прогениторах (Fuxa et al., 2004). Начальный этап активации локуса IgH состоит из перемещения локусов IgH и Ig? с периферии ядра в более центральную позицию внутри ядра в начале развития В-клеток (Kosak et al., 2002). Эта субъядерная передислокация, по-видимому, облегчает открывание хроматина и транскрипцию, характерную для зародышевой линии, ведущих к проксимальным перестройкам VH-DJH. Косвенные доказательства предполагают, что EBF1 и Рах5 играют определенную роль в центральном перемешении локусов IgH и Ig?, соответственно (Fuxa et al., 2004; Sato et al., 2004).

Хотя в про-В-клетках обе аллели локусов IgH и Ig? перемещаются в центральные позиции ядра (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004) совместно, эти две аллели ведут себя по-разному после успешной рекомбинации V(D)J в зрелых В-клетках (Skok et al., 2001). Вслед за активацией В-клеток продуктивно реорганизованные аллели Ig остаются расположенными вдали от центромерных кластеров, усиливая, таким образом, их экспрессию (Skok et al., 2001). В то же время нефункциональные аллели IgH и Ig? после активации В-клеток перемещены в центромерный хроматин и таким образом засайленсированы там. Интересно, что центромерное рекрутирование нефункциональных локусов IgH и Ig? происходит через дистальный участок их гена V, что предполагает, что те же самые последовательности ДНК участвуют в рекрутировании «молчащих» локусов Ig либо на периферию ядра, либо в центромерный гетерохроматин (Roldan et al., 2005).

3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина

Приблизительно 200 генов VH локуса IgH распространены по участку длиной более 2,4 миллионов пар нуклеотидов и могут быть разделены на 15 дистальных, центральных или проксимальных семейств генов VH в соответствии со сходством их последовательности и позицией относительно проксимальных сегментов DH. В не-В-лимфоидных клетках и лимфоидных прогениторах две аллели IgH присутствуют в удлиненной конформации на периферии ядра (Kosak et al., 2002). Напротив, в коммитированных про-В-клетках локус IgH подвергается сокращению, что сближает дистальные гены VH с перестроенным проксимальным доменом DJH, облегчая таким образом перестройки VH-DJH (рис. 21.7) (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004).

Локус Ig? с его примерно 140 генами VK также растягивается по участку длиной более 3 млн. о. и, таким образом, является таким же большим, как локус IgH. Так же, как и ген IgH в про-В-клетках, локус Ig? подвергается сокращению в малых пре-В- и незрелых В-клетках, демонстрируя, что оба локуса Ig в перестраивающихся клетках находятся в состоянии сокращения (Roldan et al., 2005). Более того, анализ с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами к дистальным, центральным и проксимальным генам показал, что выпетливание отдельных субдоменов Ig отвечает за протяженное сокращение локусов IgH и Ig? (рис. 21.7) (Roldan et al., 2005).

Дистальные перестройки VH-DJH не имеют места в про-В-клетках Рах5! (Nutt et al., 1997), несмотря на тот факт, что в гиперацетилированном состоянии хроматина гены VH доступны на всем протяжении кластера генов VH, включая наиболее дистальное семейство VHJ558 (Hessleinetal., 2003). Отсутствие перестроек дистального VH — D J коррелирует с отсутствием сокращения локуса IgH (рис. 21.7), которое, однако, может быть восстановлено посредством экспрессии ретровирусного Рах5 в про-В-клетках Рах5-/- (Fuxa et al., 2004). Следовательно, Рах5 — это ключевой регулятор сокращения локуса IgH в про-В-клетках. Метилтрансфераза гистонов Ezh2 предположительно также участвует в сокращении локуса IgH, так как условная активация Ezh2 в HSCs приводит к редукции дистальных перестроек VH- DJH, несмотря на полную доступность хроматина дистальных генов VH в про-В-клетках, дефектных по Ezh2 (Su et al., 2003). Интересно, что между Рах5 and Ezh2 не имеется генетической связи, несмотря на сходный фенотип IgH-перестройки соответствующих мутантных про-В-клеток (Fuxa et al., 2004). Поэтому, возможно, что Рах5 функционирует как сиквенс-специфичный фактор «нацеливания», чтобы рекрутировать Ezh2-содержащий репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2) к избранным участкам на локусе IgH. Возникающее метилирование локального хроматина в гистоне H3 на лизине 27 (H3K27me3) может привлекать комплекс PRC1, чтобы индуцировать сжатие хроматина целевых участков (Francis et al., 2004; обсуждается в главе 11), приводя, таким образом, к выпетливанию и к сокращению локуса IgH. В качестве альтернативы сокращение локуса может не зависеть от модификации гистонов в ядре, но предпочтительнее требует метилирования лизина сигнальных белков цитоплазматическим Ezh2-содержащим метилтрансферазным комплексом, про который известно, что он регулирует полимеризацию актина путем присоединения к фактору обмена GTP/GDP, Vavl, (Su et al., 2005).

3.4. Контроль аллельного исключения в локусах IgH и Ig?

Аллельное исключение обеспечивает продуктивную перестройку только одной из двух аллелей Ig, что приводит в В-клетках к экспрессии одиночной молекулы антитела с уникальной антигенной специфичностью.

Процесс аллельного исключения может быть разделен на два отдельных этапа. В течение фазы инициации одна из двух аллелей Ig выбирается посредством дифференциального эпигенетического маркирования, чтобы быть реорганизованной в первую очередь, что препятствует одновременной рекомбинации в двух аллелях. Экспрессия продуктивно реорганизованной аллели впоследствии предотвращает рекомбинацию во второй аллели посредством ингибирования по типу обратной связи, таким образом поддерживая аллельное исключение. Процесс аллельного исключения уже инициирован на ранних стадиях развития во время имплантации, когда две аллели гена рецептора антигена начинают асинхронно реплицироваться в каждой клетке. Отцовский или материнский ген Ig, который стохастически выбирается для ранней репликации посредством пока не известной хромосомной метки, почти всегда представляет собой ту первую аллель, которая претерпевает перестройки в незрелых В-лимфоцитах (Mostoslavsky et al., 2001). Вторая Vн-DJн-реорганизация локуса IgH является, таким образом, регулируемым этапом, так как DH-JH-рекомбинация осуществляется в обеих аллелях IgH в процессе развития про-В-клеток (Bassing et al., 2002). Однако пока так ничего и неизвестно про то, как эта аллель-специфичная эпигенетическая метка, установленная на ранних стадиях развития зародыша, транслируется в последовательную активацию Vн-DJн-рекомбинации на двух аллелях IgH.

Успешная перестройка одной аллели IgH ведет к экспрессии на поверхности клеток белка Ig? как части рецептора пре-В-клетки. Этот рецептор функционирует как важная контрольная точка, чтобы просигналить относительно пролиферативной экспансии больших пре-В-клеток, индуцировать последующую дифференцировку в малые пре-В-клетки и поддержать аллельное исключение в аллели IgH, реорганизованной по типу DJH (Kitamura and Rajewsky, 1992; Bassing et al., 2002). Экспрессия белка RAG быстро утрачивается под воздействием сигнала пре-BCR (рис. 21.8), который останавливает всю дальнейшую рекомбинацию V(D)J и подготавливает почву для установки аллельного исключения в больших пре-В-клетках (Grawunder et al., 1995). Сигнал пре-BCR также ведет к деацетилированию гистонов и, таким образом, к пониженной доступности генов VH в малых пре-В-клетках, что может быть механизмом обратной связи, лежащим в основе аллельного исключения (Chowdhury and Sen, 2003). Однако более правдоподобный механизм осуществляется быстрой реверсией сокращения локуса IgH в ответ на сигнал пре-BCR, что физйчески отделяет гены VH от проксимального домена IgH (рис. 21.8), предотвращая, таким образом, перестройку типа VH-DJH на второй аллели IgH, реорганизованной по типу DTH (Roldan et al., 2005).

Рис. 21.7. Сокращение локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в про-В-клетках

^{Локус IgH состоит из проксимального домена, содержащего следующие генные сегменты: разнообразия (diversity, D), соединительные (joining, J) и константные (constant, С), а также большой кластер вариабельных (variable, V) генов с ~200 генами V, расположенными на участке длиной более 2,4 млн. о. Локус IgH находится в растянутой конфигурации в про-В-клетках Pax5-/- или Ezh2-/-, что позволяет V(0)1-рекомбинации осуществиться только в проксимальном домене. В про-В-клетках дикого типа все гены VН участвуют в перестройках VН-DH благодаря сокращению локуса IgH путем выпетливания}

Более того, пре-BCR сигнал ведет к быстрому перемещению нефункционирующей аллели IgH к репрессивным центромерным доменам (Roldan et al., 2005). Следовательно, утрата сокращения локуса и центромерное рекрутирование изменяют реорганизованную по типу DJH аллель IgH во время образования свободного от RAG окна пре-В-сигнала таким образом, что она не может более подвергаться перестройкам типа VH-DJH после последующей реэкспрессии белков RAG в малых пре-В-клетках (рис. 21.8).

Рис. 21.8. Аллельное исключение путем устранения сокращения локуса IgH в пре-В-клетках

^{В ранних про-В-клетках реорганизации типа DH-JH происходят одновременно в обеих аллелях IgH, тогда как в поздних про-В-клетках только одна аллель в это время подвергается рекомбинации по типу VH-DJH. Ядра рассортированных про-В- и пре-В-клеток были проанализированы трехмерным DNA-FISH с флуоресцентными зондами из дистального (красный) и проксимального (зеленый) участков локуса IgH. Две аллели IgH одной и той же клетки показаны на двух репрезентативных конфокальных срезах. Пре-BCR сигнал приводит не только к быстрой потере белка RAG, но и к устранению сокращения локуса IgH. Хотя обе аллели не находятся в состоянии сокращения, локус IgH полностью растянут только в случае не окончательно DJH-перестроенной аллели. Эти два сигнала функционально перестроенной аллели (VDJ+) разделены более коротким расстоянием благодаря делеиии внедренной последовательности ДНК. Данные по FISH взяты из Roldan et al. (2005)}

Инициация аллельного исключения в локусе Ig? изучалась, в значительной степени, посредством исследования паттерна метилирования ДНК с помощью рестрикционных ферментов, чувствительных к метилу (Mostoslavsky et al., 1998; Goldmit et al., 2002;, 2005), и, наряду с этим, посредством анализа гетерозиготных по репортеру ?°-GFP мышей, содержащих вставку гена GFP в элементе J?1 эндогенного локуса Ig? (Liang et al., 2004). Локус Ig? сильно метилирован в динуклеотидах CpG во всех не-В и про-В-клетках, но становится специфически деметилирован только на одной аллели в пре-В-клетках (рис. 21.9) (Mostoslavsky et al., 1998; Liang et al., 2004). Это моноаллельное деметилирование предваряет перестройку и зависит от активности как интронных, так и 3’ к — энхансеров (Mostoslavsky et al., 1998). Эта деметилированная аллель находится в доступном хроматине, так как он чувствителен к ДНКазе I, гиперацетилирован по гистонам H3 и Н4 и расположен в пре-В-клетках вдали от центромерного хроматина (рис. 21.9) (Goldmit et al., 2002, 2005). Как следствие, только неметилированная аллель Ig? инициирует транскрипцию зародышевой линии и перестройки типа V?-J? (Goldmit et al., 2002; Liang et al., 2004), тогда как в малых пре-В-клетках обе аллели подвергаются сокращению локуса (рис. 21.9) (Roldan et al., 2005). На удивление, в пре-В-клетках вторая аллель Ig? перемещается в центромерный гетерохроматин (Goldmit et al., 2005), аналогично локусу IgH (Roldan et al., 2005).

Это моноаллельное центромерное рекрутирование (рис. 21.9) может объяснить, почему для аллели с метилированной ДНК характерно пониженное ацетилирование гистонов и почему она связана с белками НР1у и Ikaros, которыми наряду с комлексами деацетилазы гистонов обогащен центромерный хроматин (Goldmit et al., 2005). Интересно, что именно поздно реплицирующаяся аллель Ig? перемещается в центромерные кластеры (Goldmit et al., 2005) в соответствии с тем, что паттерн асинхронной репликации, уже установленный на ранних стадиях развития эмбриона, коррелирует с моноаллельной инициацией перестроек Ig? в пре-В-клетках (Mostoslavsky et al., 2001). Удивительно, что только очень малая доля (5 %) всех пре-В-клеток подвергается активации локуса Ig? у мышей ?°-GFP (Liang et al., 2004).

^{Рис. 21.9. Механизмы, контролирующие аллельное исключение в локусе Ig?}

^{В пре-В-клетках субъядерное перемещение, деметилирование ДНК и ацетилирование гистонов вносят свой вклад в выбор одной аллели Ig? для VK-JK-рекомбинации. Для детального объяснения см. текст. Обозначены: дистальный участок VK (красный) и проксимальный домен JK-CK (зеленый) локуса IgK, и их расположение относительно репрессивного компартментов на периферии ядра (серый) и центромерным хроматином (синий). У этих двух аллелей состояния сокращения локуса, метилирования ДНК (me) и ацетилирования гистонов (ас) схематично показаны для разных стадий развития, включая активированные зрелые В-клетки}

На основании этого результата была выдвинута гипотеза, что в пре-В-клетках определенные транскрипционные факторы, присоединяющиеся к cis-регуляторным элементам локуса Ig?, присутствуют в лимитирующих количествах и что совместное присоединение таких факторов к энхансерам Ig? является редким событием, происходящим стохастически только в одной аллели. Следовательно, стохастическая активация энхансера посредством аллельной конкуренции за лимитирующие транскрипционные факторы может внести свой вклад в аллельное исключение в локусе Ig? (Liang et al., 2004). Успешная перестройка одной аллели Ig? ведет к экспрессии BCR на поверхности клетки, которая впоследствии поддерживает аллельное исключение во второй аллели Ig? посредством подавления экспрессии рекомбиназы RAG 1/2 (Jankovic et al.. 2004).

4. Конечная дифференцировка зрелых В-клеток

4.1. Дифференцировка плазматических клеток

Завершение рекомбинации V(D) J и экспрессия рецептора иммуноглобулина (Ig) на поверхности В-клетки маркируют конец антиген-независимой фазы В-лимфопоэза. Начиная с этой точки отсчета, судьба В-клеток начинает зависеть от сигнала рецептора, индуцированного антигеном (Rajewsky, 1996). В отсутствие антигена периферические В-клетки поддерживаются в покоящемся состоянии, где их выживание обеспечивается тонизирующими сигналами с BCR клеточной поверхности (Kraus et al., 2004). Сравнение организации хроматина в покоящихся и активированных В-клетках показывает, что покой В-клеток характеризуется низкими уровнями общего метилирования гистонов (Baxter et al., 2004). Относительно высокие уровни ацетилирования гистонов в покоящихся В-клетках остаются стабильными в процессе активации клеток (Baxter et al., 2004). Общее снижение метилирования лизинов гистонов, включая возможное отсутствие метилирования гистона H3K9, коррелирует с отсутствием других признаков конститутивного хроматина, таких как ассоциация Ikaros и связывание НР1 в покоящихся В-клетках (Baxter et al., 2004). Активация В-клеток восстанавливает метилирование гистонов, которое приводит к увеличению активной метки H3K4me3 на генах, требующихся для функционирования В-клетки (Рах5), и к одновременному повышению репрессивной модификации H3K9me2 на «молчащих» генах (Dntt) (Baxter et al., 2004). Реорганизация хроматина, индуцированная активацией, может поддерживать идентичность В-клетки в течение иммунного ответа. Однако геном В-клетки должен оставаться подверженным перепрограммированию, вызванному антигеном, так как активированные В-клетки после первой встречи с антигеном способны дифференцироваться прямо в плазматические клетки, продуцирующие антитела (Calame et al., 2003).

Как альтернатива, антигенная стимуляция может инициировать реакцию зародышевого центра. В процессе этой реакции зрелые IgMlow IgDhlgh В-клетки включают свои иммуноглобулиновые изотипы и производят мутации в своих генах Ig с помощью цитидиндеаминазы, индуцированной активированием (AID; Honjo et al., 2004). Белки Ig, возникшие в результате этих процессов, идеально подходят для дифференцировки и поддержки В-клеток памяти, или для развития плазматических клеток, которые продуцируют антитела с высоким сродством к определенному антигену (Honjo et al., 2004). Время реакций зародышевого центра и превращение В-клеток в плазматические клетки регулируются двумя взаимоисключающими репрессорами транскрипции — Вс16 и Blimp 1 (рис. 21.10) (Turner et al., 1994; Ye et al., 1997). Bcl6 экспрессируется на низком уровне в зрелых наивных В-клетках, но быстро ап-регулируется в некоторых В-клетках после антигенной стимуляции (Fukuda et al., 1997). Клетки, которые не ап-регулируют Вс16, после встречи с антигеном дифференцируются в плазматические клетки, которые служат начальным источником антител с низкой аффинностью (Fukuda et aL, 1997).

Наоборот, В-клетки, которые ап-регулируют Вс16, входят в реакцию зародышевого центра (Fukuda et al., 1997) и поддерживаются как В-клетки за счет Вс16-опосредованной репрессии генов, которые контролируют дифференцировку плазматических клеток (Shaffer et al., 2000). Одной из ключевых мишеней Вс16 является ген Prdm1, кодирующий транскрипционный фактор Blimp1 (рис. 21.10). Интересно, что, оказывается, Рах5 помогает Вс16 в репрессии гена Blimp1 (Prdm1) (рис. 21.10) (Delogu et al., 2006). Однако, начав однажды экспрессироваться, Blimp 1 аннулирует транскрипционную программу В-клеток, включая экспрессию Вс16 и Рах5, и одновременно вызывает транскрипцию генов, специфичных для плазматических клеток (Shaffer et al., 2002; Calame et al., 2003). Bcl6 и Blimp 1 используют широкий арсенал репрессивных механизмов для инактивации транскрипции генов. Один характерный аспект Вс16 — это использование ацетилирования лизина за рамками модификации гистонов, чтобы контролировать репрессию генов (Bereshchenko et al., 2002). Вс16 взаимодействует с МТАЗ, субъединицей корепрессорного комплекса Mi-2/NuRD, который в высокой степени экспрессируется в В-клетках зародышевого центра (Fujita et al., 2004). Ассоциация Вс16 с комплексом Mi-2/ NuRD, содержащим МТАЗ, необходима для репрессии гена, так как истощение МТАЗ, опосредованное RNAi, ведет к реактивации репрессированных Вс16 генов-мишеней в В-клетках (Fujita et al., 2004). Функция репрессии комплекса Вс16/МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от статуса ацетилирования остатков лизина как в Вс16, так и в гистонах, связанных с локусом репрессированного гена. Для осуществления взаимодействия центрального домена Вс16 с МТАЗ он должен быть деацетилирован, тогда как репрессия гена посредством комплекса МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от деацетилаз гистонов HDAC1 и HDAC2 класса I (Fujita et al., 2004).

Рис. 21.10. Транскрипционная репрессия определяет судьбу В-клеток зародышевого центра и плазматических клеток