Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Эффективность предимплантационного развития реконструированных ооцитов в бластоцисты особенно

чувствительна к таким экспериментальным параметрам, как стадия клеточного цикла и физическое состояние пересаживаемого ядра. Например, клонирование неделящихся донорских клеток более эффективно, чем клонирование активно пролиферирующих клеток (Campbell et al., 1996а; Cibelli et al., 1998). Так, как и ожидалось из этого отношения, яйцеклетки, реконструированные с использованием донорских ядер из фибробластов, клеток Сертоли, кумулюса или клеток NKT, находящихся в фазе Gj или G₀ клеточного цикла, достигают стадии бластулы с относительно высокой эффективностью в противоположность клеткам ES или клеткам эмбриональной карциномы (ЕС), которые активно делятся и большая доля которых находится в фазе S (табл. 22.2). Благодаря экспериментальной вариабельности в ходе дробления измерение доли бластоцист, полученных из реконструированных ооцитов, не является надежным критерием для количественной оценки «способности к репрограммированию». Однако, коль скоро клонированный эмбрион достиг стадии бластоцисты, после имплантации в матку его развитие до рождения зависит от состояния дифференцировки донорского ядра. Клонированные эмбрионы, полученные от таких эмбриональных доноров, как клетки ES или ЕС, развиваются до рождения с эффективностью в 10—20 раз более высокой, чем эмбрионы, полученные от донорских клеток кумулюса или фибробластов (Eggan et al., 2001; Wakayama and Yanagimachi. 2001). предположительно потому, что ядро недеференцированной клетки более склонно к репрограммированию или нуждается в нем в меньшей степени, чем ядро дифференцированной соматической клетки. Это указывает на обратное отношение между стадией дифференцировки донорской клетки и эффективностью репрограммирования. Наконец, коль скоро эмбрион достиг стадии бластоцисты, он с довольно существенной вероятностью может дать начало клеткам ES; это показывает, что получение клеток ES из эксплантированных бластоцист гораздо меньше зависит от состояния дифференцировки донорского ядра (табл. 22.2).

В ранних экспериментах по клонированию амфибий и млекопитающих популяции донорских клеток, используемых для трансплантации ядер, были гетерогенными, и нельзя было исключить, что начало редким выживающим клонам дали редкие взрослые стволовые клетки, присутствующие в донорской популяции, а не ядра дифференцированных клеток. Например, эпигенетическое состояние соматических стволовых клеток может походить на состояние эмбриональных стволовых клеток, легче репрограммируется и, таким образом,может предпочтительно давать выживающие клоны. Чтобы решить вопрос о том, можно ли ядро терминально дифференцированной клетки репрограммировать в достаточной мере для получения взрослого животного, требовались генетические маркеры, по которым можно было бы ретроспективно идентифицировать донорское ядро выжившего клона. Такие маркеры были использованы для однозначной демонстрации того, что ядра из зрелых иммунных клеток, из терминально дифференцированных нейронов и из злокачественных раковых клеток могут быть репрограммированы и могут дать взрослых клонированных мышей.

Моноклональные мыши были получены с использованием ядер периферических лимфоцитов, где генетические перестройки генов иммуноглобулина (Ig) и рецептора Т-клеток (TCR) можно было использовать в качестве стабильных маркеров, позволяющих выявлять идентичность и состояние дифференцировки донорского ядра данного клона. Поскольку предшествовавшие попытки получить моноклональных мышей были безуспешными, использовали процедуру двухэтапного клонирования, чтобы сначала получить клетки ES из клонированных бластоцист, а затем, на втором этапе, моноклональных мышей из клонированных клеток ES (рис. 22.6). Животные, полученные из донорских ядер В- и Т-клеток, были жизнеспособными и несли полностью перестроенные гены иммуноглобулина или TCR во всех тканях (Hochedlinger and Jaenisch, 2002). Как и ожидалось, иммунные клетки моноклональных мышей экспрессировали только те аллели локуса Ig и TCR, которые были продуктивно перестроены в соответствующих донорских клетках, использованных для пересадки ядер, а перестройка других генов Ig или TCR была подавлена. Эти результаты однозначно показывают, что ядра из терминально дифференцированных донорских клеток могут быть репрограммированы до состояния плюрипотентности с помощь клонирования ядер. Частота непосредственно получаемых клонированных эмбрионов из зрелых В- и Т-клеток (вместо двухэтапной процедуры, использованной в наших экспериментах), хотя ее и трудно оценить, была, вероятно, существенно ниже, чем частота клонов, полученных из фибробластов или клеток кумулюса (возможно, меньше I на 2000 оперированных эмбрионов; табл. 22.2). Недавно были непосредственно клонированы терминально дифференцированные клетки NKT (Inoue et al., 2005). Клетки NKT, подобно В- и Т-клеткам, обладают генетическими перестройками, делающими возможной ретроспективную идентификацию состояния дифференцировки этих клеток. Однако, хотя Т- клетки и клетки NKT и являются частью одной и той же клеточной линии, соответствующая эффективность ядерных пересадок существенно различалась (Hochedlinger and Jaenisch, 2002; Inoue et al., 2005).

Рис. 22.6. Двухэтапная процедура для получения моноклональных мышей из зрелых лимфоидных донорских клеток

^{(1) Ядра из клеток периферического лимфатического узла пересаживали в денуклеированные яйцеклетки и получали клонированные бластоцисты. Эти бластоцисты эксплантировали in vitro и получали клонированные клетки ES. (2) На втором этапе получали моноклональных мышей путем тетраплоидной комплементации (Eggan et al., 2001; Hochedlinger and Jaenisch, 2002)}

В противоположность В- и Т-клеткам ядра постмитотических нейронов необратимо выходят из клеточного цикла; в этом заключается часть программы их дифференцировки. Для проверки того, можно ли ядро зрелого нейрона репрограммировать до состояния тотипотентности, были получены фертильные клонированные взрослые мыши из постмитотических обонятельных нейронов с использованием такого же подхода, какой был применен для получения моноклональных мышей (см. рис. 22.6) (Eggan et al., 2004; Li et al., 2004). Как показано в табл. 22.2, эффективность получения клонированных клеток ES из обонятельных нейронов была в том же диапазоне, что и эффективность для ядер иммунных клеток. Эти наблюдения показывают, что постмитотическое нейрональное ядро может вновь вступить в клеточный цикл и его можно репрограммировать к плюрипотентности.

У мыши каждая из двух миллионов клеток в обонятельном эпителии экспрессирует только один из приблизительно 1500 генов рецепторов запаха (OR, odor-ant receptor), так что функциональная идентичность нейрона определяется природой рецептора, который он экспрессирует (это аналогично моноаллельной экспрессии генов иммунного глобулина или TCR в В- или Е-клетках, которая обсуждалась в главе 21). Один из механизмов, который обеспечивал бы стохастический выбор единственного обонятельного рецептора, мог бы быть связан с перестройками ДНК. Получение мышей, клонированных из зрелых обонятельных нейронов, позволило исследовать, связан ли выбор обонятельного рецептора с необратимыми перестройками ДНК. Если выбор обонятельного рецептора связан с необратимыми перестройками ДНК, можно было бы предсказать, по аналогии с описанными выше моноклональными мышами, что мышь, клонированная из нейрона, экспрессирующего Р2, будет экспрессировать этот рецептор во всех обонятельных нейронах и репертуар экспрессии рецепторов будет изменен (это были бы моносомные мыши, которые могли бы чувствовать только один запах) (рис. 22.7). Наоборот, если выбор OR связан с обратимым эпигенетическим механизмом, клонированные животные должны демонстрировать картину экспрессии Р2, идентичную той, которую демонстрирует мышь-донор, и нормальный репертуар экспрессии рецептора. Анализ экспрессии обонятельного рецептора показал, что механизм выбора рецептора полностью обратим и не связан с генетическими изменениями, как это видно при созревании В- и Т-клеток (Eggan et al., 2004).

Рис. 22.7. Клонирование ядер зрелых обонятельных нейронов

^{Мыши, клонированные из зрелых обонятельных нейронов имели нормальный репертуар экспрессии обонятельных рецепторов (ОЮ, в котором лишь 0,1 % нейронов экспрессируют рецептор Р2. — как и у мышей-доноров Экспрессию рецептора Р2 определяли, используя мышей-доноров, имевших ген маркера GFP, вставленный в ген рецептора Р2. Результаты этого опыта показали, что выбор экспрессии рецептора определяется не генетическими изменениями, а обратимым эпигенетическим механизмом}

Клонирование мышей из терминально дифференцированных лимфоцитов и постмитотических нейронов продемонстрировало, что пересадка ядер дает нам в руки инструмент для избирательного репрограммирования эпигенетического состояния клеточного генома без изменения его генетического состава. Рак вызывается генетическими, а также эпигенетическими изменениями, но влияние эпигенетики на злокачественный фенотип раковой клетки не было определено. Трансплантацию ядер раковых донорских клеток использовали как прямой подход к оценке обратимости трансформированного состояния. Действительно, предыдущие эксперименты с амфибиями показали, что ядра из клеток карциномы почки можно репрограммировать, и они будут поддерживать раннее развитие до стадии головастика (McKinnell, 1962). Аналогичный результат был получен на мышах, где ядра из линии клеток медуллобластомы смогли обусловить, хотя и с низкой эффективностью, раннее развитие, в результате чего были получены эмбрионы с задержкой дальнейшего развития (Li et al., 2003). Однако эти эксперименты не были однозначной демонстрацией того, что эти клоны были получены из раковых клеток, а не из загрязняющих культуру нетрансформированных клеток. Когда ядра целого ряда опухолевых клеток, в том числе клеток лейкемии, лимфомы, рака груди и меланомы, пересадили в денуклеированные мышиные яйцеклетки, большинство из них оказались способными поддерживать предимплатационное развитие до стадии нормально выглядящих бластоцист (Hochedlinger et al., 2004). Следовательно, внутриклеточная среда ооцита смогла подавить злокачественный фенотип этих опухолевых клеток и сделать возможным внешне нормальное раннее развитие. Однако лишь геном от модельной меланомы, индуцированной RAS, дал начало линии клонированных клеток ES, способных дифференцироваться в большинство, если не во все линии соматических клеток в химерных мышах. Тем не менее, из-за генетических изменений, имевшихся в донорских клетках, у всех этих химер развивался рак. Эти результаты показывали, что раковое ядро после взаимодействия с цитоплазмой яйцеклетки обеспечивало дифференцировку всех линий, показывая тем самым, что злокачественный фенотип этих раковых клеток в основном определялся эпигенетическими изменениями. Другой вывод был сделан из экспериментов по клонированию ядер донорских клеток ЕС. В противоположность ядру соматической раковой клетки злокачественный фенотип эмбриональных опухолей был обусловлен генетическими изменениями, поскольку его не удавалось обратить экспозицией с цитоплазмой яйцеклетки (Blelloch et al., 2004).

4. Изменения, связанные с репрограммированием ядра

Стратегии, используемые в раннем развитии, у амфибий и у млекопитающих очень различаются. Например. дробление эмбриона лягушки проходит быстро, примерно по 30 минут на каждый клеточный цикл, в противоположность эмбриону млекопитающих, который проходит всего лишь одно деление дробления за 24 часа после оплодотворения. Кроме того, зиготический геном лягушки начинает экспрессироваться лишь спустя 12 митотических циклов, на переходе к средней бластуле, в противоположность геному мышиного эмбриона, активирующемуся на 2-клеточной стадии. Таким образом, можно не удивляться тому, что эти различные стратегии развития, используемые у амфибий и млекопитающих, влияют и на репрограммирование соматического донорского ядра. В этой главе эпигенетическое репрограммирование, имеющее место в нормальном развитии, сопоставляется с репрограммированием у клонов лягушек и млекопитающих. Интересный вопрос заключается в том, влияет ли эпигенетическое состояние соматического донорского ядра на картину экспрессии генов у клонированных эмбрионов. Это называется «эпигенетической памятью» и будет обсуждаться далее в этой главе.

4.1. Амфибии

У амфибий ядра и хромосомы ооцитов и яйцеклеток находятся в состоянии, совершенно ином, чем ядра и хромосомы соматических клеток. Зародышевый пузырек ооцита содержит максимально расправленные [expanded] хромосомы типа ламповых щеток, очень активные в отношении транскрипции (Callan and Lloyd, 1960), что, очевидно, отражает не только высокую долю транскрибируемых генов, но и плотную упаковку РНК-полимераз на ДНК большинства генов. Это исключительное транскрипционное состояние достигается во время раннего оогенеза и вероятно продолжается в яичнике на протяжении всей жизни взрослой самки. Зрелые спермин, напротив, максимально конденсированы и полностью неактивны в отношении транскрипции. Обычные гистоны хромосом в сперме заменены протаминами, которые обмениваются в ядрах спермиев, которые входят в яйцеклетку при оплодотворении, и ядра спермиев претерпевают необычайно быструю деконденсацию приблизительно за 20 минут. У амфибий отсутствуют процессы, эквивалентные инактивации Х-хромосомы и импринтингу, которые имеют место у млекопитающих Снижение уровня метилирования ДНК имеет место в период от оплодотворения до перехода к средней бластуле (5 часов), после чего этот уровень постепенно повышается по мере развития (Meehan, 2003). Резюмируя, можно сказать, что в нормальном развитии во время гаметогенеза и в течение нескольких часов непосредственно после оплодотворения имеют место существенные события репрограммирования ядра.

Наиболее очевидным изменением, которое претерпевают трансплантированные ядра у амфибий, является увеличение объема и дисперсия хроматина. В ядрах эмбриональных клеток это происходит быстрее, чем в ядрах дифференцированных илц взрослых клеток. Во всех отношениях эти трансплантированные ядра в конце концов принимают состояние ядер, присутствующих в яйцеклетках или ооцитах в норме. После трансплантации ядра наступают также изменения в синтезе нуклеиновых кислот. В ядрах неделящихся клеток, таких как клетки мозга взрослых животных, яйцеклетки быстро индуцируют синтез ДНК. Эмбрионы-трансплантаты, полученные в результате пересадок одиночных ядер в яйцеклетки, синтезируют рибосомную РНК и тРНК в такой же степени, что и эндогенные ядра эмбрионов, выращенных из оплодотворенных яиц. Картина транскрипции генов изменяется от характерной для донорских клеток к свойственной ранним эмбрионам; например, вся генная транскрипция выключается во время дробления эмбрионов-трансплантатов и затем реактивируется у выживших трансплантатов в соответствии с клеточным гипом. Мышечные гены экспрессируются в мышцах эмбрионов-трансплантатов даже в том случае, если они получены от ядер кишечника (Gurdon et al., 1984).

В случае пересадок ядер в ооциты в трансплантированных ядрах имеют место обширные изменения в транскрипции без какой-либо репликации ДНК. Например, у Xenopus ядра из клеток почки подавляют гены, специфичные для почки, и активируют гены, специфичные для ооцита. Некоторые из этих заново активированных генов специфичны для эмбриона, как и в случае ядер тимуса мыши, которые экспрессируют маркерный для стволовых клеток ген Oct-4, но подавляют активность специфичного для тимуса гена Thy-1 (Byrne et al., 2003). В заключение можно сказать, что у амфибий при пересадках ядер в яйцеклетки или ооциты наблюдается обширное репрограммирование транскрипции генов, так что ядра соматических клеток (и. в случае яйцеклеток, их митотическое потомство) изменяют свою транскрипцию в соответствии с транскрипцией клетки-реципиента.

С давних пор думали, что наиболее вероятное объяснение возрастающей доли связанных с развитием аномалий, наблюдаемой в экспериментах с пересадкой ядер у амфибий, связано с неполной репликацией ДНК. При нормальном развитии Xenopus пронуклеусы яйцеклетки и спермия начинают удвоение хромосом спустя 20 минут после оплодотворения, и оно завершается 20 минутами позже. В противоположность этому ядрам делящихся клеток в культуре требуется около 6 часов для завершения одного раунда репликации ДНК. Неудивительно поэтому, что часто можно наблюдать продолжение синтеза ДНК пересаженными ядрами соматических клеток гораздо дольше 40 минут после инъекции ядра — вплоть до начала конденсации хромосом для первого митоза. В результате репликция хромосом может быть неполной, и неполностью реплицированные хромосомы разрываются на части, когда трансплантированные ядра вынуждены вступать в свой первый митоз. Фрагменты разорванных хромосом наблюдали в эмбрионах, полученных в результате пересадки ядер (Di Berardino and Hoffner, 1970), и эта несовместимость между скоростью репликации ДНК и клеточного деления в зиготе по сравнению с соматическими ядрами, приводящая к анеуплоидии, по-видимому, скорее всего объясняет многие аномалии развития эмбрионов, полученных путем пересадки ядер, и в особенности высокую долю яйцеклеток, вообще неспособных пройти регулярное дробление; эти последние могут составить до 75 % всех яиц, получивших ядра от неделящихся дифференцированных клеток. Было отмечено, что серийные пересадки ядер из частично дробящихся эмбрионов, полученных в результате первой пересадки, часто дают нормальное развитие головастиков (см. выше). Это хорошо объясняется тем, что инкубация ядер соматических клеток в экстракте из яйцеклеток, находящихся в фазе митоза, значительно увеличивает число сайтов начала репликации ДНК, тем самым давая таким ядрам возможность завершить репликацию хромосом быстрее, чем это могут ядра из таких терминально дифференцированных клеток, как эритроциты (Lemaitre et al., 2005).

Два других предположения могут помочь объяснить аномалии ядерных трансплантатов, которые возникают после начала зиготической транскрипции при переходе к средней бластуле. Первое связано с количественной нерегулярностью активации ранних зиготических генов (Byrne et al., 2003), а второе — с сохранением специфичной для донора экспрессии генов в некорректной зародышевой линии эмбрионов-трансплантатов (см. ниже). Однако не было показано, что эти отличия от нормальной экспрессии генов прямо отвечают за наблюдаемые аномалии развития.

Большие количества и крупные размеры яиц и ооцитов амфибий вдохновили исследователей на попытки понять молекулярные основы репрограммирования. Наиболее предпочтительным путем было получение бесклеточных экстрактов, с помощью которых можно было бы воспроизвести in vitro события, происходящие после пересадки ядер в живые яйцеклетки и ооциты. Последовательное обеднение этих экстрактов могло бы позволить идентифицировать необходимые компоненты. Этот подход оказался особенно успешным при идентификации компонентов яйцеклетки, инициирующих синтез ДНК. В особенности можно отметить идентификацию нуклеоплазмина (Laskey etal., 1978; Philpott et al., 1991), присутствующего в больших количествах компонента яйцеклетки Xenopus, который может деконденсировать спермий и стимулировать обмен гистоновых белков. Такие же процессы имеют место, когда соматические ядра добавляются в экстракты из яйцеклеток (Dimitrov and Wolffe, 1996; Tamada et al., 2006). Другие компоненты экстракта яйцеклеток, возможно вносящие вклад в процесс репрограммирования ядра, включают комплекс ремоделинга ISW1 (Kikyo et al., 2000) и белки зародышевой клетки ERGY2, функция которых — обратимая разборка ядрышек (Gonda et al, 2003). Было высказано предположение, что ремоделирующий комплекс BRG-1 может играть роль в яйцеклетках и у ранних эмбрионов путем пермеабилизации и ресилинга [by permeabilizing and resealing] ядер в экстрактах (Hansis et al., 2004). Эти опыты трудно интерпретировать, потому что пока еще не известно, чтобы бесклеточные экстракты были способны инициировать транскрипцию ядер. Поэтому лучшее, что можно сделать, — это воздействовать на ядра in vitro и затем пересадить их в живой ооцит, чтобы испытать на транскрипцию (Byrne et al., 2003; Tamada et al., 2006).

В настоящее время представляется, что для успешного репрограммирования ядер необходимы три этапа: (1) удаление эпигенетических меток на ДНК или белках, которые характеризуют данное дифференцированное состояние; (2) обеспечение транскрипционными факторами, необходимыми для тех генов, которые должны быть заново экспрессированы; и (3) деконденсация хроматина для того, чтобы транскрипционные факторы получили доступ к генам, на которые они действуют.

4.2. Млекопитающие

Последовательное эпигенетическое репрограммирование является важным аспектом нормального развития (Rideout et al., 2001). В ходе гаметогенеза на два родительских генома последовательно накладываются изменения метилирования ДНК, а также гистонов. После оплодотворения геном эмбриона модифицируется далее в ходе дробления и после имплантации. В табл. 22.3 дается сводка данных о некоторых эпигенетических отличиях клонированных животных от нормальных, которые возникают в результате ошибочного репрограммирования. Для последующего обсуждения мы подчеркиваем эти эпигенетические различия между эмбрионами, полученными в результате нормального оплодотворения и клонирования, на разных стадиях развития. Стадии развития, указанные в табл. 22.3 и обсуждаемые по порядку, — это (1) гаметогенез, (2) дробление, (3) постимплантация и (4) постнатальное развитие.

Наиболее важное эпигенетическое репрограммирование в нормальном развитии происходит во время гаметогенеза — процесса, который делает и геном спермия, и геном ооцита «эпигенетически компетентными» для последующего оплодотворения и для надежной активации генов, критичных для раннего развития (Latham et al., 1999). При клонировании этот процесс сокращается, и большинство проблем, затрагивающих «нормальность» клонированных животных, может быть связано с неадекватным репрограммированием соматического ядра после трансплантации в яйцеклетку. Поскольку плацента развивается из трофоэктодермальной линии, составляющей первый дифференцированный тип клеток эмбриона, можно было бы предположить, что у большинства клонированных животных репрограммирование и дифференцировка в эту раннюю клеточную линию нарушены. Действительно. как подытожено ниже, доля аномально экспрессируемых генов у клонированных новорожденных животных существенно выше в плаценте по сравнению с соматическими тканями.

В ходе дробления проходящая по всему геному волна деметилирования удаляет эпигенетические модификации, присутствующие в зиготе, так что ДНК бластописты в основном лишена метилирования. Между имплантацией и гаструляцией волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирования, которая затем поддерживается на протяжении всей жизни в соматических клетках данного животного. У клонированных эмбрионов метилирование повторяющихся последовательностей является ненормальным (Bourc’his et al., 2001; Dean et al., 2001; Kang et al., 2003; Mann et al., 2003). Чтобы исследовать экспрессию генов, активность таких «генов плюрипотентности», как Oct-4, которые «молчат» в соматических клетках, но активны в эмбриональных клетках, была изучена у клонированных эмбрионов. Удивительно, но реактивация Oct-4 и «Oct-4-подобных» генов оказалась ошибочной и случайной у большой доли соматических клонов (Boiani et al., 2002; Bortvin et al., 2003). Поскольку эмбрионы без Oct-4 рано останавливаются в развитии, неполная реактивация «Oct-4-подобных» генов у клонов могла быть причиной частой неспособности большей части эмбрионов, полученных в результате пересадки ядер, выжить в постимплантационном периоде. Более того, в ряде исследований обнаружено аномальное метилирование ДНК у клонированных эмбрионов. Хотя остается все еще невыясненным, в какой степени эпигенетическая модификация структуры хроматина и метилирование ДНК, происходящие в нормальном развитии, должны имитироваться при ядерном клонировании, для того чтобы оно было успешным, имеющиеся данные полностью согласуются с представлением о том, что причиной аномальной экспрессии генов у клонированных животных является ошибочное эпигенетическое репрограммирование.

После имплантации и перед гаструляцией три ключевых события формируют эпигенетическое состояние генома эмбриона: (1) волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирования, характерную для взрослого животного и поддерживаемую в дальнейшем в соматических клетках на протяжении всей жизни (Dean et al., 2003); (2) у эмбрионов женского пола выполняется компенсация доз посредством случайной инактивации одной из двух Х-хромосом; (3) теломеры приобретают длину, характерную для соматических клеток. Поскольку все эти события инициируются только у постзиготического эмбриона, у клонированных животных можно ожидать мало нарушений в регуляции этих эпигенетических событий. Тем не менее, у клонированных эмбрионов коровы наблюдали более низкие уровни общего метилирования по сравнению с постнатальными телятами (Cezar et al., 2003). Инактивация Х-хромосомы была случайной и ненарушенной у здоровых, но не у аномальных клонированных эмбрионов мышей (Eggan et al., 2000; Senda et al., 2004: Nolen et al., 2005). Однако неясно, действительно ли эти нарушения являются причиной аномального развития клонов, а не просто следствием аномального репрограммирования в ходе предимплантационного развития. Напротив, коррекция длины теломер у клонированных коров и мышей надежно выполнялась (Lanza et al., 2000; Tian et al., 2000; Wakayama et al., 2000; Betts et al., 2001) и, таким образом, не могла быть причиной нарушенной жизнеспособности клонированных животных.

Самый масштабный анализ экспрессии генов был выполнен на новорожденных клонированных мышах. Профиль экспрессии показал, что 4—5 % всего генома и 30—50 % импринтированных генов аномально экспрессируются в плацентах новорожденных клонированных мышей (Humpherys et al., 2002; Kohda et al., 2005). Это говорит о том, что развитие млекопитающих удивительно толерантно к широко распространенной дисрегуляции и что компенсаторные механизмы обеспечивают выживание некоторых клонированных особей вплоть до рождения. Однако эти результаты заставляют предполагать, что даже выживающие клоны могут иметь легкие дефекты, которые, хотя и не настолько серьезны, чтобы создавать риск для непосредственного выживания, в более позднем возрасте могут послужить причиной возникновения ненормального фенотипа.