Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2.2. Млекопитающие

Самые ранние попытки клонировать млекопитающих были выполнены с эмбрионами кроликов. В этих экспериментах ооциты сливали с клетками, взятыми от эмбрионов на стадии морулы, и было видно, что получающиеся в результате этого триплоидные клоны проделывали несколько делений дробления (Bromhall, 1975). В 1984 году МакГрат и Солтер применили слияние с помощью вируса Сендай для эффективной пересадки донорских ядер в денуклеированные зиготы. Этот метод был использован для экспериментов двух типов: (1) получают однородительские эмбрионы, замещая мужской пронуклеус женским (что дает начало гиногенетическому зародышу) или замещая женский пронуклеус мужским (что дает начало андрогенетическому эмбриону) (McGrath and Solter, 1984а,b; Suranietal., 1984). Однородительские эмбрионы не развиваются и неизменно погибают, давая первое доказательство того, что нормальное развитие млекопитающих критическим образом зависит от родительски-специфичного геномного импринтинга (2) Клонированные эмбрионы были получены путем пересадки ядер от эмбрионов-доноров, находящихся на стадии дробления, в денуклеированные зиготы. Ни один из таких реконструированных эмбрионов не развивался дальше поздней стадии дробления, из чего следует, что тотипотентность генома в ходе раннего развития быстро утрачивается и что клонирование млекопитающих, в противоположность амфибиям, может быть невозможным (McGrath and Solter, 1984b). Однако результаты, полученные на других видах млекопитающих, вскоре поставили этот вывод под сомнение.

 В 1986 году Вилладсену (Willandsen) удалось клонировать живых ягнят из ядер 4—16-клеточного эмбриона и вскоре после этого последовало создание клонированных телят и свиней (Robi et al., 1987; Prather et al., 1989). Почему клонирование сельскохозяйственных животных оказалось успешным в противоположность хорошо контролируемым экспериментам по клонированию мышей (McGrath and Solter, 1984Ь)? Основное различие в развитии этих видов животных заключается в сроках перехода от материнского контроля развития (на основе запасенной матерью РНК) к зиготическому контролю развития (на основе зиготически продуцируемой РНК). Этот основной переход, по-видимому, происходит на 8—16-клеточной стадии у овец и крупного рогатого скота (Calarco and McLaren, 1976; Camous et al., 1986), но уже на 2-клеточной стадии у эмбрионов мышей (Bolton et al., 1984). Таким образом, у клонируемых эмбрионов овец или коров временные ограничения для активации донорского генома могут быть менее жесткими, чем у клонируемых эмбрионов мышей, где для того, чтобы происходило дробление, донорское ядро должно быть активировано вскоре после пересадки.

Первым успешным получением клонированных животных путем пересадки ядра соматической клетки, а не пересадки ядра из клеток-доноров эмбриона на стадии дробления, было получение овцы из культивируемых фибробластов донора (Campbell et al., 1996b). За этим вскоре последовало создание «Долли» из донорского ядра клетки молочной железы (Wilmut et al., 1997); «Долли» оказалась первым млекопитающим, клонированным из донорской клетки взрослого животного. С тех пор были клонированы всего 15 видов млекопитающих, в том числе мыши, козы, свиньи, коровы, кролики, крысы, кошки и собаки (обзор см. Campbell et al., 2005).

Процедура клонирования млекопитающего, как и клонирование амфибий, включает два этапа. В большинстве, если не во всех успешных экспериментах по пересадке ядра соматической клетки, донорские ядра переносились в денуклеированные ооциты ( в отличие от ранних опытов по клонированию мышей, где донорское ядро от эмбриона на стадии дробления вводилось в денуклеированную зиготу; McGrath and Solter, 1984). На первом этапе пипеткой удаляли метафазное веретено яйцеклетки-реципиента, вслед за чем в денуклеированное яйцо пересаживали донорское ядро. У большинства млекопитающих донорское ядро вводилось в яйцеклетку путем электрослияния с денуклеированным яйцом. У мышей яйцеклетки особенно легко повреждаются, и пересадка ядра у этого вида наиболее эффективна путем физического переноса донорского ядра в яйцо (Wakayama et al., 1998). Как изображено на рис. 22.2, донорское ядро вводится в денуклеированное яйцо с помошью пьезоэлемента, который облегчает проникновение через zona pellucida и цитоплазматическую мембрану (Wakayama et al., 1998). Клонированные бластоцисты либо имплантируются в матку псевдобеременной приемной матери, чтобы получить клонированных мышей, либо эксплантируются в тканевую культуры, чтобы получить эмбриональные стволовые клетки от пересадки ядра (NT-ES, nuclear transfer embryonic stem cells). Клетки NT-ES генетически идентичны донору и могут, следовательно, использоваться для «заказной» («customized») клеточной терапии, называемой также «терапевтическим клонированием» (см. ниже).

Рис. 22.2. Пересадка ядер у мышей с помощью микроинъекций

^{(а) Схематическое изображение процедуры ядерной пересадки. Когда бластоциста эксплантируется на облученные клетки-фидеры, внутренняя клеточная масса (ICM) дает начало клеткам ES. Будучи перенесенной в синхронизированную псевдобеременную самку, такая бластоциста может развиться в мышь. Наружные клетки бластоцисты — трофэктодерма (ТЕ) — дают начало экстра- эмбриональным тканям (плаценте), а клетки ICM генерируют эмбрион, (б) Те же этапы, что и на а, показаны с помощью световой микроскопии (воспроизведено, с любезного разрешения, из Meissner, 2006)}

3. Фенотип клонированных животных

Получение животных путем пересадки донорских ядер соматических клеток не эффективно, и те редкие животные, которые доживают до взрослого состояния, часто обнаруживают множественные аномалии. В отличие от этого, когда в качестве доноров ядер используются эмбриональные клетки, выживаемость клонов и у амфибий, и у млекопитающих гораздо выше В следующей главе акцент делается на отношении между возрастом донорского ядра и его влиянием на выживаемость клона в сопоставлении с фенотипом клонов амфибий и млекопитающих, полученных из взрослых и эмбриональных донорских клеток.

3.1. Амфибии

Когда ядра бластулы трансплантируются в хорошего качества реципиентныеяйцаЛсяо/ж?, свыше 30 % таких яиц развиваются в нормальных головастиков, и большинство этих последних можно вырастить до стадии фертильных взрослых животных. По мере того как донорские клетки дифференцируются, степень нормальности развития трансплантантных эмбрионов снижается (рис. 22.3), не столь быстро в случае эндодермальных донорских ядер, как при использовании других. У амфибий оказались информативными серийные ядерные пересадки, в которых донорские ядра берутся из бластулы, которая сама была получена в результате пересадки ядра соматической клетки (рис. 22.4). Это делается потому, что клетки эмбриона от первой пересадки часто представляют собой мозаику клеток, нормальных и ненормальных по хромосомам, из-за различий в скорости репликации ДНК между соматической клеткой и активированным яйцом; серийные трансплантации ядер демонстрируют возможности развития у ядер эмбриона от первой пересадки, которые меньше повреждены ядерной пересадкой. Несколько нормальных половозрелых, генетически маркированных лягушек, самцов и самок, были получены даже при использовании кишечного эпителия питающихся личинок (Gurdon and Uehlinger, 1966). Этот результат показывал, что процесс дифференцировки не обязательно связан с утратой способности обеспечивать нормальное развитие, и, следовательно, принцип сохранения генома по мере дифференцировки клеток не нарушается.

Рис. 22.3. Выживаемотъ эмбрионов Xenopus, полученных в ре­ зультате пересадки ядер снижается номере того, как донорские ядра берутся из все более и более специализированных донорских клеток

^{Сокращения, обозначающие стадию: (В) бластула; (G) гаструла: (N) нейрула; (ТВ) стадия хвостовой почки: (НВ) стадия биения сердца; (ST) стадия плавающего головастика; (FT) стадия питающегося головастика (перепечатано, с любезного разрешения, из Gurdon, 1960)}

В опытах по трансплантации ядер у амфибии оказалось невозможным получить нормальное взрослое животное из ядра другой взрослой особи. Однако морфологически нормальные головастики были получены из ядер клеток многих различных тканей взрослых особей (Laskey and Gurdon, 1970), и эти головастики имели нормальный набор функционирующих специализированных типов клеток. Следовательно, клетки, коммитированные в направлении одного пути дифференцировки, содержат, тем не менее, генетический потенциал, обеспечивающий в комбинации с цитоплазмой яйца большинство неродственных типов клеточных дифференцировок.

Способность ядер одного клеточного типа обеспечивать другие типы клеточных дифференцировок можно оценить количественно, проверив, в какой степени функциональная мышечная и нервная дифференцировка, о которой можно судить по эмбрионам, совершающим плавательные движения после стимуляции, может быть достигнута при использовании ядер кишечного эпителия от плавающих головастиков. Такие эмбрионы часто могут быть получены с помощью серийных пересадок ядер от эмбрионов, полученных в результате первой пересадки, которые не совсем нормальны (см. рис. 22.4) (Gurdon, 1962). Кроме того, клетки бластулы от морфологически дефектных эмбрионов от первой пересадки могут формировать мышцы, будучи пересажены нормальным хозяевам, выращенным из оплодотворенных яиц (рис. 22.4) (Byrne et al., 2003). Этот результат показывает, что до 30 % клеток кишечного эпителия могут приводить, после пересадки ядер, к формированию функциональных аксиальных мышечных клеток (табл. 22.1). Спектр аномалий, возникающих в результате пересадки ядер у амфибий, не обнаруживает какого-либо постоянного характера, который на морфологическом уровне можно было бы соотнести с происхождением донорской клетки. Независимо от типа клеток и стадии развития донорских ядер эмбрионы, полученные в результате трансплантации ядер, погибают со сходным набором дефектов, включающим неполное дробление, неспособность к гаструляции, дефектное формирование оси и отсутствие структур головы. Внешне беспорядочная природа этих дефектов не удивительна, поскольку известно, что в клетках эмбрионов от первой пересадки часто наблюдаются крупные хромосомные аномалии (см. раздел 4.1, подраздел «Репрограммирование в клонах»).

Рис. 22.4. Серийные пересадки ядер и пересадки ткани у Xenopus

^{Для стандартных первых пересадок единичное ядро соматической клетки трансплантируют в денуклеированное яйцо, которое затем выращивается прямо до стадии личинки Для серийных пересадок ядер эмбрион от первой пересадки на ранней стадии развития используется как донор ядер для дальнейшей серии пересадок ядер в яйцеклетки. Эти эмбрионы, полученные в результате серийных ядерных пересадок, выращиваются до стадии головастика. Наконец, от эмбриона, полученного в результате первой пересадки, который частично дефектен, берут кусочек ткани для пересадки эмбриону-хозяину, выращенному из оплодотворенного яйца. Пересаженная ткань становится частью вырастающего головастика}

3.2. Млекопитающие

Большинство клонированных эмбрионов млекопитающих вскоре после имплантации перестают развиваться. Те же, которые доживают до рождения, часто обнаруживают общие аномалии вне зависимости от типа донорских клеток (табл. 22.2). Например, новорожденные клоны часто оказываются «переростками» и обнаруживают увеличенную плаценту; эти симптомы называют Синдромом Крупного Потомства (Large Offspring Syndrome) (Young et al., 1998; Hill et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Более того, новорожденные клоны часто страдают респираторным дистрессом и дефектами почек, печени, сердца и мозга. Даже особи, выживающие длительное время, могут обнаруживать аномалии на последующих стадиях жизни. Например, стареющие клонированные мыши часто становятся ожиревшими, у них развиваются серьезные проблемы с иммунитетом или они преждевременно погибают (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Как схематически представлено на рис. 22.5, две стадии, когда большинство клонов погибают, — это стадия непосредственно после имплантации и при рождении. Эти две стадии являются критичными для развития и могут быть особо чувствительными к ошибочной экспрессии генов (см. ниже). Однако получение взрослых и внешне здоровых клонированных животных было воспринято как доказательство, что пересадка ядер может давать нормальных клонированных животных, хотя и с низкой эффективностью. Важно отметить, что серьезные аномалии у клонированных животных могут часто проявляться лишь при старении животных (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Стохастическое возникновение заболеваний и других дефектов в более позднем возрасте у многих или даже у большинства взрослых клонов означает, что компенсаторные механизмы, позволяющие клонированным животным выжить, не гарантируют их «нормальность». Скорее, фенотип выживающих клонированных животных оказывается распределенным по широкому спектру, который включает как аномалии, вызывающие внезапную смерть в раннем постнатальном возрасте, так и более легкие аномалии, позволяющие дожить до более преклонного возраста (рис. 22.5). Эти соображения иллюстрируют сложность определения легких дефектов генной экспрессии и подчеркивают необходимость более сложных тест-критериев, таких как тесты на стресс, вызываемый внешними факторами, или поведенческие тесты.

Аномалии, характерные для клонированных животных, не наследуются потомством клонов, показывая, что их причиной являются «эпигенетические», а не генетические отклонения. Это потому, что эпигенетические изменения, в противоположность генетическим, являются обратимыми модификациями ДНК или хроматина, которые «стираются» при прохождении генома через зародышевый путь (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Таким образом, проблемы, связанные с клонированием, обусловлены ошибочным «эпигенетическим/ геномным репрограммированием» трансплантированного донорского ядра, а не соматическими мутациями, приобретаемыми в соматических донорских клетках.

Рис. 22.5. Выживаемость клонов млекопитающих

^{Фенотипы клонов распределяются в широком диапазоне аномалий. Большинство клонов погибают на двух определенных стадиях развития — при имплантации и при рождении. Более мелкие аномалии генной экспрессии приводят к заболеваниям и смерти в более позднем возрасте}

3.3. Получение клонированных млекопитающих из терминально дифференцированных клеток

Вопрос, уже возникавший в плодотворных экспериментах по клонированию у амфибий, заставлял предполагать наличие обратной зависимости между состоянием клеточной дифференцировки донорского ядра и его способностью направлять развитие после пересадки в яйцеклетку (см. выше и рис. 22.3). Важно было выяснить, влияет ли состояние дифференцировки донорской клетки на эффективность репрограммирования и у млекопитающих. Как показано в табл. 22.2, репрограммирование можно измерить функционально, оценив развитие клонов на нескольких разных уровнях, включая (1) скорость формирования бластоцисты после пересадки ядра в яйцо, (2) долю клонированных эмбрионов, выживающих до рождения или до взрослого состояния после имплантации в матку, и (3) частоту, с которой из клонированных бластоцист, эксплантированных в культуру, можно получить плюрипотентные эмбриональные стволовые (ES) клетки.