Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

5. Эпигенетическая память

Известно, что в развитии позвоночных имеют место два рода эпигенетических модификаций генома. Это метилированный цитоцин во многих участках ДНК, где имеется CpG, и разнообразные модификации «хвостов» гистонов. Эти изменения приобретаются в ходе гаметогенеза и раннего развития и тесно связаны с активностью или неактивностью генов. Поэтому можно было ожидать, что эти эпигенетические модификации подвергнутся реверсии в результате пересадки ядра, а если нет, то могут помочь объяснить некоторые дефекты развития эмбрионов, полученных в результате трансплантации ядер.

У амфибий некоторое понимание деметилирования ДНК было достигнуто в экспериментах, где ядра соматических клеток млекопитающих были инъецированы в ооциты Xenopus (Simonsson and Gurdon, 2004). Промотор Oct-4 мышей метилирован в клетках взрослого тимуса, где Oct-4 не экспрессируется. Однако, когда ядра тимуса были инъецированы в ооциты, этот промоторный район, но не энхансерный район регуляторной части этого гена, был деметилирован. Этот результат показывает избирательный характер процесса деметилирования. Когда были инъецированы целые ядра, деметилирование ДНК, по-видимому, предшествовало индуцированной транскрипции Oct-4. Весьма вероятно, что активность ДНК-деметилазы является специальным свойством ооцитов (см. выше) и что деметилирование промоторной ДНК репрессированных в развитии генов может также быть важным и необходимым этапом, когда ядра соматических клеток репрограммируются в экспериментах с пересадкой ядер в яйцеклетки. Изменения в модификациях гистонов пока еще не были исследованы в экспериментах по пересадкам ядер у амфибий.

Эксперимент по пересадкам ядер у амфибий, поставленный по другой схеме, показал, что реверсия эпигенетического состояния соматических клеток никоим образом не наблюдается всегда. Ввиду невозможности получить ядерных трансплантантов у R. pipiens, даже от клеток-доноров с ранней стадии хвостовой почки (см выше), Бриггс и Кинг (Briggs and King, 1957) задались вопросом, не отражает ли морфология аномальных эмбрионов их происхождение; они описали предпочтительное выживание эндодермальных тканей у эмбрионов эндодермального ядерного происхождения и назвали это «эндодермальным синдромом». Указывалось, однако, что эндодерма дифференцируется позже, чем другие зародышевые листки, и что этим можно было бы объяснить ее лучшее выживание (Gurdon, 1963). Действительно, Симнет (Simnet, 1964) сообщил, что эмбрионы-трансплантаты нейрального происхождения также обнаруживали такое же предпочтительное выживание их эндодермы. Тот же вопрос недавно был снова исследован с использованием специфичных для клеточного типа маркерных генов. В этих опытах (Ng and Gurdon, 2005) ядра из клеток нейроэктодермы или эндодермы, уже экспрессирующих специфичные для клеточного типа маркеры Sox2 или эндодермин, соответственно, трансплантировали в денуклеированные яйцеклетки; получившиеся в результате эмбрионы-трансплантанты были разделены на нейроэктодермальную или эндодермальную части, и эти части были протестированы на те же маркеры, Sox2 или эндодермин (рис. 22.8 и табл. 22.4). Оказалось, что оба гена преимущественно экспрессировались в клетках «не своего» типа. Например, более половины эмбрионов нейроэктодермального происхождения обнаружили суперэкспрессию нейрального маркера Sox2 в своих эктодермальных клетках. У некоторых клонированных эмбрионов не было снижения уровня экспрессии гена Sox2 по сравнению с уровнем донорских клеток. Трансплантированные ядра, как и ядра нормальных эмбрионов, были совершенно неактивными в отношении транскрипции вплоть до стадии бластулы. Следовательно, как это ни удивительно, активное состояние генной транскрипции, установившееся в ходе клеточной дифференцировки, может поддерживаться в клонированных эмбрионах при полном отсутствии условий, которые индуцировали этот ген на протяжении более 12 митотических клеточных делений (от яйцеклетки до бластулы). Этот поразительный пример эпигенетической памяти наблюдается лишь у некоторых эмбрионов-трансплантатов, но полностью отсутствует у других, у которых экспрессия гена была успешно репрограммирована.

^{Рис. 22.8. Схема эксперимента по тестированию эпигенетической памяти об экспрессии генов, специфичной для данного клеточного типа}

^{Донорские ядра берутся из клеток эндодермы (стадия 21) или нейроэктодермы (стадия 26). Получающиеся в результате пересадки ядер эмбрионы обычно формируют частичную бластулу, нормально дробившиеся части которой разделяют на будущие нейроэктодермальные или эндодермальные участки и анализируют по экспрессии генов. См. табл. 22.4 (перепечатано, с любезного разрешения, из Ng and Gurdon, 2005)}

^{В процентах представлена доля эмбрионов, полученных путем трансплантации ядер (каждый тестировался методом RT-PCR индивидуально), экспрессирующих гены Edd и Sox2 в два и более раза интенсивней нормального (или фонового) уровня (данные из NG and Gurdon, 2005)}

6. Значение ядерной трансплантации для медицины

Важно различать «репродуктивное клонирование» и «терапию с помощью трансплантации ядер» (называемую также SCNT, или терапевтическое клонирование). При репродуктивном клонировании путем пересадки соматического ядра в денуклеированную яйцеклетку получают эмбрион с целью создать клонированную особь. Напротив, целью терапии с помощью трансплантации ядер является получение линии эмбриональных стволовых клеток (обозначаемых как клетки ntES), «скроенных» для нужд пациента, послужившего донором ядер (Hochedlinger and Jaenisch, 2003).

Клетки ntES могли бы быть использованы как источник функциональных клеток, пригодных для лечения соответствующего заболевания путем трансплантации. На рис. 22.9 сопоставляются нормальное развитие из оплодотворенного эмбриона, репродуктивное клонирование и терапевтическое клонирование.

6.1. Репродуктивное клонирование

Как представлено выше, все данные, полученные в экспериментах по клонированию восьми разных видов млекопитающих, показывают, что получение нормальных особей с помощью пересадки ядер сталкивается с несколькими важными препятствиями. В общественных дебатах ключевым вопросом является вопрос о том, будет ли когда-нибудь возможно путем ядерного клонирования получить нормальную особь. Имеющиеся данные заставляют предполагать, что получение нормальных клонов может оказаться затруднительным, если не невозможным, по следующим причинам: (1) Как подытожено выше, все проанализированные клоны при рождении обнаруживают дисрегуляцию сотен генов. Тем не менее, развитие клонов до рождения и далее, несмотря на широко распространенные эпигенетические аномалии, позволяет предполагать, что развитие млекопитающих способно выдерживать дисрегуляцию многих генов.

(2) Некоторые клоны выживают до взрослого состояния за счет компенсации дисрегуляции генов. Хотя эта «компенсация» обеспечивает выживание, она не может предотвратить возникновение расстройств, проявляющихся в более позднем возрасте. Следовательно, можно ожидать, что большинство клонов, если не все, будут иметь по крайней мере легкие аномалии, которые могут быть не настолько серьезными, чтобы проявиться в виде очевидного фенотипа при рождении, но вызовут серьезные проблемы в последующем, как это видно у стареющих мышей. Разные клоны могут различаться по степени аномальной экспрессии генов: если ключевые «Oct-4-подобные» гены не активируются, клоны погибают немедленно после имплантации. Если же эти гены активированы, клон может выжить до момента рождения и дольше. Эти соображения показывают, что клонированные животные, даже если при поверхностном обследовании они выглядят «нормальными», могут не быть таковыми, но обладать слабыми аномалиями, которые фенотипически проявятся лишь в более позднем возрасте (Jaenisch, 2004). Эти соображения не позволяют рассматривать этот подход как потенциальную репродуктивную технологию у человека.

Рис. 22.9. Сравнение нормального развития с «репродуктивным клонированием» и «терапевтическим клонированием»

^{Во время нормального развития (слева) гаплоидная (In) клетка спермия оплодотворяет гаплоидный ооцит, в результате чего формируется диплоидная (2п) зигота, которая подвергается дроблению и становится зародышем-бластопистой. Бластописты, имплантированные в матку, в конечном счете дают начало новорожденным животным. В ходе «репродуктивного клонирования» (в центре) диплоидное ядро донорской клетки взрослого животного вводится в денуклеированный репипиентный ооцит. который, после искусственной активации, делится и превращается в клонированную бластоцисту. После пересадки суррогатным матерям некоторые из этих клонированных бластопист дают начало новорожденному клону. В противоположность этому, получение клеток ntES с помощью пересадки ядер (справа) требует эксплантации клонированных бластоцист в культуру для получения линии клеток ES, которая может дифференцироваться in vitro в клетки потенциально любого типа, входящие в состав тела, и использоваться для исследовательских или терапевтических целей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society])}

6.2. Применение ядерной трансплантации в терапии

Иммунное отторжение — частое осложнение при трансплантациях аллогенных органов, обусловленное иммунологической несовместимостью. Для лечения этой болезни «хозяин против прививки» реципиентам с трансплантатами обычно дают лекарства-иммунодепрессанты, что дает серьезные побочные эффекты. Эмбриональные стволовые клетки, полученные с помощью трансплантации ядер, генетически идентичны клеткам пациента, устраняя, таким образом, риск иммунной реакции и потребность в подавлении иммунитета. Что особенно важно, разрабатываются протоколы, позволяющие получать такие функциональные клетки, как нейроны, мышечные клетки и островковые клетки, которые можно использовать для лечения пациентов, страдающих такими серьезными нарушениями, как болезнь Паркинсона, сердечная недостаточность или диабет. Более того, эмбриональные стволовые клетки обеспечивают возобновляемый источник замещения тканей, позволяя проводить повторное лечение, когда это необходимо.

Действительно, осуществимость терапевтического клонирования была продемонстрирована на животных моделях болезней. Для этого в качестве «пациента» был использован штамм мышей, несущих делецию гена Rag2 (Rideout et al., 2002). Мыши, мутантные по Rag2. страдали серьезной комбинированной иммунной недостаточностью (SCID) из-за мутации в гене, катализирующем перестройки иммунорецептора в лимфоцитах. У этих мышей не было зрелых В- и Т-клеток, и это состояние было похоже на заболевание у человека («bubble babies»). На рис. 22.10 суммированы этапы этого эксперимента. На первом этапе ядра соматических донорских клеток (фибробластов) из хвостов дефектных по Rag2 мышей инъецировали в денуклеированные яйцеклетки Получившиеся в результате эмбрионы культивировали до стадии бластоцисты и изолировали аутологичные клетки ES. Затем одна из мутантных аллелей Rag2 была «сделана мишенью» для восстановления нормальной структуры гена с помощью гомологичной рекомбинации в клетках ES Чтобы получить соматические клетки для лечения, эти клетки ES были дифференцированы в эмбриоидные тела (эмбриоподобные структуры, содержащие различные типы соматических клеток) и далее в предшественники гематопоэза путем экспрессии НохВ4. Получившиеся в результате предшественники гематопоэза трансплантировали облученным животным, дефектным по Rag2, для лечения заболевания. Эти клетки генерировали функциональные В- и Т-клетки, которые проделали соответствующие перестройки своих аллелей иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора, как и сывороточных иммуноглобулинов, в трансплантных мышах Rag2. Этот эксперимент продемонстрировал, что пересадку ядер, в сочетании с генной терапией, можно использовать для лечения генетических нарушений. Следовательно, терапевтическое клонирование должно быть применимо и в случае других заболеваний с известным генетическим дефектом, таких как серповидноклеточная анемия или бета-талассемия. Нерешенным остается вопрос, будет ли трансплантация ядер у человека столь же эффективной, как у коров, или такой же неэффективной, как у мышей.

Рис. 22.10. Схема терпевтического клонирования в сочетании с генной и клеточной терапией

^{Культивировали кусочек хвоста от мыши, гомозиготной по мутации активирующего рекомбинацию гена 2 (Rag2). Когда выросли фибробластоподобные клетки, они были использованы в качестве доноров для пересадки ядер путем прямой инъекции в денуклеированные ооциты MII с помощью микроманипулятора с пьезоэлектрическим управлением. Эмбриональные стволовые (ES) клетки, изолированные из полученных пересадкой ядер бластоцист, были генетически репарированы методом гомологичной рекомбинации. После репарации клетки ntES были дифференцированы in vitro в эмбриоидные тела (EBs), инфецированы ретровирусом HoxB4iGFP. размножены и инъецированы в хвостовую вену облученных, дефектных по Rag2 мышей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society])}

Использование ящерного клонирования для получения «заказных» [«customized»] клеток ES для восстановления тканей вызывает противоречивые оценки, поскольку, как утверждают его противники, само получение клеток ES с необходимостью было бы связано с разрушением потенциального человеческого существа. В качестве возможного решения этой этической дилеммы была предложена измененная пересадка ядра (ANT, altered nuclear transfer) как модификация обычной процедуры пересадки ядра (Hurlbut, 2005). ANT включает инактивацию гена в соматических донорских клетках, который необходим для развития плаценты, и тем самым предотвращает образование плода, поскольку ANT-бластоциста была бы не способна к имплантации (и, таким образом, не разрушалась бы никакая потенциальная человеческая жизнь), но все еще позволяла бы получать «заказные» ES-клетки. Используя Cdx2 в качестве гена-мишени, провели эксперимент на мышах по принципиальной проверке этого подхода, ANT (Meissner and Jaenisch, 2006). Остается посмотреть, удовлетворит ли эта модификация ANT тех, кто возражает против получения клеток ES из клонированных бластоцист человека.

6.3. Репродуктивное versus терапевтическое клонирование: в чем разница?

Почемы ошибочное репрограммирование порождает столько проблем для репродуктивного клонирования, но не для терапевтических приложений? Наиболее важная причина этого кажущегося парадокса заключается в том, что, в отличие от репродуктивного клонирования, использование ядерных пересадок для целей терапии не требует формирования плода, основываясь вместо этого на прямой дифференцировке функциональных клеток в культуре. Поскольку нет потребности в развитии плода, не следует ожидать, что функциональность дифференцированных клеток, получающихся в результате этого процесса, будет затронута нарушенным импринтингом, который в значительной мере определяет неспособность клонов к развитию (Jaenisch, 2004). Поскольку клетки ES, полученные из оплодотворенных эмбрионов, способны участвовать в формировании всех нормальных эмбриональных тканей, клетки ES, полученные с помощью пересадки ядер, должны обладать такой же способностью генерировать полный спектр нормальных тканей. Действительно, все имеющиеся данные согласуются с выводом о том, что клетки ES, полученные из клонированных эмбрионов, биологически и молекулярно неотличимы от клеток ES, полученных из оплодотворенных эмбрионов (Brambrink et al., 2006). Таким образом, если человеческие клетки ES, полученные из IVF-эмбрионов, пригодны для лечения болезней, то это же относится и к «заказным» клеткам ES, полученным с помощью ядерного клонирования из клеток пациента.

Литература

Betts D., Bordignon V, Hill J., Winger Q., Westhusin M., Smith L., and King W., 2001. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 1077-1082.

Blelloch R.H., Hochedlinger K., Yamada Y., Brennan C., Kim M., Mintz B., Chin L., and Jaenisch R., 2004. Nuclear cloning of embryonal carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 13985-13990.