Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

РНК roX были выделены после совместной иммунопреципитации белков MSL, демонстрируя тем самым физическую ассоциацию этих РНК с данным комплексом (Meller et al., 2000; Smith et al., 2000). Неизвестно, сосуществуют ли РНК roX или же образуют два отдельных типа MSL. Серия делеций roX1 показала, что нет ни одного сегмента длиной 300 нуклеотидов, который был бы абсолютно существенным для функции, что заставляет предполагать внутреннюю избыточность (Stickenholz et al., 2003). HYR roX демонстрируют удивительный уровень гибкости; это позволяет думать, что они, скорее, могут декорировать поверхность комплекса MSL, чем образуют в нем какую-то высокоинвариантную структуру Частичная очистка комплекса позволяет предполагать наличие плотного кора, состоящего из белков MSL1, MSL2, MSL3 и MOF, причем РНК roX и геликаза MLE сохраняются лишь при очень низких концентрациях солей (Smith et al., 2000) Этот минимальный белковый коровый комплекс, лишенный РНК roX, все еще может in vitro специфически ацетилировать в нуклеосомах гистон Н4 по лизину 16 (Morales et al., 2004), что согласуется с идеей, что РНК roX участвуют в сборке или «нацеливании» компенсации дозы, а не играют прямую роль в регуляции генов.

Как комплекс MSL связывается с Х-хромосомой и что он распознает? В отсутствие обеих РНК roX или же либо MLE, MSL3, либо MOF частичные комплексы MSL связываются с подгруппой из 35—70 сайтов (рис. 16.6). Эти «высокоаффинные» сайты сравнили у мутантов mle, msl3 и mof и нашли, что на цитологическом уровне они в большой мере одинаковы, но их молекулярная идентичность пока еще неизвестна. Ключевым дефектом у мутантов mle может быть их неспособность инкорпорировать РНК roX в частичные комплексы, поскольку эти РНК ко-локализуются вместе с частичными комплексами в отсутствие MSL3 или MOF, но не в отсутствие MLE (Meller et al., 2000). В отсутствие либо MSL1, либо MSL2 ни один из остальных белков MSL или РНК roX не сохраняет способность распознавать Х-хромосому, что приводит к предположению, что MSL1 и MSL2 совместно обеспечивают по крайней мере первоначальную специфичность «нацеливания» на X. Тем не менее, ни один из этих белков не несет известный ДНК-связывающий мотив, и связывание с ДНК in vitro не было продемонстрировано.

Рис. 16.6. «Высокоаффинные» сайты

^{Препараты хромосом слюнных желез из личинок, несущих аллель типа «утраты функции» гена msl3 (а, б), или из контрольных личинок дикого типа (в. г). На а и г показаны изображения, полученные с фазовым контрастом, тогда как на б и в показаны те же хромосомы с иммуноокрашиванием на присутствие комплекса. На б комплекс (зеленый цвет) обнаруживается в меньшем числе сайтов, чем на в (перепечатано, с любезного разрешения, из: Demakova et al., 2003 [©Springer]}

Что же могло бы быть сигналом специфичности на Х-хромосоме, что привлекало бы этот комплекс? Можно представить себе две очень общие модели регулирования целой хромосомы. Одиночный сайт или ограниченное число сайтов могли бы контролировать хромосому в cis-конфигурации, как это имеет место в случае Х-инактивации у млекопитающих (глава 17). Этот механизм требует либо компартментализации комплекса в специфическом месте ядра, либо регулирования на очень больших расстояниях посредством распространения факторов из центрального района на остальные части хромосомы. В соответствии с другим крайним вариантом, хромосома могла бы иметь уникальные идентифицирующие последовательности, разбросанные по всей ее длине. В этом случае любой сегмент хромосомы мог бы регулироваться автономно. Между этими двумя моделями находится целый спектр возможностей, включая комбинацию центральных контрольных районов с диспергированными последовательностями, которые облегчают регуляцию на больших расстояниях.

РНК roX в норме кодируются Х-хромосомой: ген roX1 находится возле ее конца, а ген roX2 — около середины эухроматической части Х-хромосомы. Подобно гену Xist у млекопитающих гены roX могут находиться на Х-хромосоме для того, чтобы «нацеливать» сборку комплекса MSL на эту хромосому. Когда гены roX перемещаются на аутосомы как трансгены, они энергично привлекают белки MSL к новым сайтам, в которые произошла вставка (рис. 16.7), где этот комплекс, по-видимому, распространяется в cis-конфигурации на разные расстояния во фланкирующие последовательности (Kelley et al., 1999; Kageyama et al., 2001). В специфических генетических условиях, например когда на Х-хромосоме нет конкурирующих эндогенных генов roX, неизменно наблюдается экстенсивное распространение с аутосомных трансгенов roX (рис. 16.7) (Park et al., 2002). Это экстенсивное распространение усиливается сверхэкспрессией MSL1 и MSL2, ключевых лимитирующих белков MSL, и уменьшается сверхэкспрессией РНК roX с конкурирующих трансгенов, позволяя предполагать, что успешная ко-транскрипционная сборка комплексов MSI может управлять локальным распространением (Oh et al., 2003). Эффективная сборка функциональных комплексов MSL в ядре может быть первичной функцией РНК roX. Первоначальная сборка в генах roX на Х-хромосоме должна, вероятно, усиливать эффективность «нацеливания» на Х-хромосому, но очевидно не является существенной для окончательного «нацеливания», поскольку гены roX могут функционировать в trans-конфигурации (Meller and Rattner, 2002)

Рис. 16.7. Распространение комплекса MSL от аутосомного трансгена пропорционально ослаблению функции эндогенных, сцепленных с X, генов roХb

^{Максимальное аутосомное распространение достигается тогда, когда трансген является единственным источником РНК гоХ в клетке, (а) Хромосомы от самца с X дикого типа; присутствие аутосомного трансгена показывает узкая полоска MSL (красный цвет), (б) Самец с одним только активным сцепленным с X геном roХ. Комплекс MSL распространяется несколько больше, чем у дикого типа, (в, г) Экстенсивное распространение у самцов, несущих два разных трансгена и Х-хромосому с делецией обоих генов гоХ (перепечатано, с любезного разрешения, из: Park et al., 2002 [©AAAS])}

Помимо высокоаффинных сайтов, упоминавшихся выше, очевидно, что этот комплекс обнаруживает разные степени сродства к большому числу дополнительных сайтов вдоль всей Х-хромосомы (Demakova et al., 2003). В стабильных транслокационных штаммах распространение комплексов MSL с Х-хромосомы в смежные аутосомные последовательности не является очевидным (Fagegaltier and Baker, 2004). Следовательно, даже если распространение комплексов MSL является главным механизмом покрытия [covering] Х-хромосомы, весьма вероятно, что имеется некая дополнительная характеристика Х-хромосомы, являющаяся причиной того, что комплекс MSL очень благоприятствует связыванию с X, а не с аутосомами. Действительно, в результате исследования транслокаций Х: А и ограниченного набора полученных из X трансгенов оказывается, что большинство сегментов Х-хромосомы длиной — 30 т. о. обладают способностью привлекать комплекс MSL; более мелкие сегменты дают менее постоянные результаты (Oh et al., 2004).

Каким образом эти разнообразные наблюдения можно согласовать с моделью «нацеливания» комплекса MSL на Х-хромосому? Модель узнавания Х-хромосомы, лучше всего согласующаяся с существующими данными, изображена на рис. 16.8. В этой модели комплексы MSL собираются в сайтах транскрипции РНК roX и впоследствии получают доступ к фланкирующим и удаленным сайтам на Х-хромосоме на основе их относительного сродства к комплексу MSL. Происходит ли некоторая или даже основная часть «нацеливания» в норме исключительно в trans-конфигурации или же путем некоторого варианта локального распространения в cis-конфигурации — неизвестно. Однако ясно, что комплекс MSL явно предпочитает связываться с сегментами Х-хромосомы, а не с аутосомами. Хотя на сегодняшний день не известно, чтобы какая-то простая нуклеотидная последовательность однозначно определяла Х-хромосому, возможно, будет обнаружена некая вырожденная последовательность, когда целые геномы многочисленных видов Drosophila станут доступными для сравнения.

5. Балансировка между антагонистическими активностями ремоделинга хроматина

Политенная Х-хромосома самцов обнаруживает особую чувствительность к изменениям в дозе или активности нескольких регуляторов хроматина, которые, как полагают, являются общими, хромосома-неспецифичными факторами. Например, выяснить функциональное взаимодействие между комплексами, несущими ISWI, и комплексом MSL позволило наблюдение, что мутации гена Iswi типа «утраты функции» приводят у самцов к глобальному структурному эффекту в отношении Х-хромосомы: на препаратах слюнных желез эта хромосома выглядит чрезвычайно укороченной и толстой (рис. 16.9), причем комплекс MSL и H4K16ас располагаются внешне непрерывно, а не в виде тонких бэндов (Deuring et al., 2000). Молекулярная основа этого цитологического фенотипа неизвестна, но он совместим с моделью, в которой организация хроматина в отдельные домены была утрачена. Нормальные политенные хромосомы демонстрируют характерный паттерн относительно конденсированных дисков и деконденсированных междисковых участков и пуфов, и эта организация оказывается полностью отсутствующей в Х-хромосоме мутантных самцов Iswi. Короткая длина этой X может быть обусловлена утратой структуры и конденсацией, результатом чего является аномальное увеличение толщины за счет длины.

ISWI (imitation switch protein) — это АТФаза, обнаруженная у Drosophila в трех комплексах ремоделинга хроматина: NURF (nucleosome remodeling factor), ACF (ATP-dependent chromatin assembly and remodeling factor) и CHRAC (chromatin accessibility complex) (Smith and Peterson, 2005). Исследования in vitro показали, что ACF и CHRAC устанавливают регулярно упорядоченные цепочки нуклеосом, тогда как NURF нарушает периодичность нуклеосом. In vivo ACF и CHRAC ведут себя как факторы сборки хроматина, способствующие формированию хроматина в целом и репрессивных состояний хроматина в частности. Напротив, NURF изменяет положение нуклеосом на промоторе hsp 70, реконструированном in vitro, и его ремоделирующая активность существенно усиливается, если нуклеосомы сначала гиперацетилируются. Несмотря на очевидную биохимическую активность NURF в том отношении, что он делает хроматин более доступным, мутанты по nurf301 также обнаруживают аномально деконденсированную Х-хромосому у самцов, наблюдаемую у мутантов Iswi (Badenhorst et al., 2002).

Рис. 16.8. Модель «нацеливания» комплекса MSL на Х-хромосому

^{Комплекс собирается в сайте транскрипции генов roХ и получает доступ к различным сайтам по всей Х-хромосоме, сродство к которым у него варьирует от очень высокого до относительно низкого. Обратите внимание на то, что эта модель приложима к аутосомному распространению комплекса от эктопического гена roХ}

Дефект Х-хромосомы, наблюдаемый в слюнных железах мутантов Iswi и nurf. можно видеть у трансгенных самок, где было индуцировано присутствие комплекса MSL; этот дефект не возникает в присутствии неактивного комплекса MSL у самцов, т. е. в отсутствие H4K16ас. Более того, исследования методом конкурирующего связывания in vitro [in vitro competition studies] с очищенным ISWI позволяют предполагать, что его способность взаимодействовать с изолированными нуклеосомами снижается ацетилированием «хвоста» гистона Н4 по лизину 16 (Corona et al., 2002). Согласно выдвинутому этими авторами спекулятивному предположению, активность MOF изменяет экспрессию сцепленных с X генов, уменьшая способности ISWI стимулировать формирование регулярных нуклеосомных последовательностей (Corona et al., 2002).

Рис. 16.9. Гипоморфные мутации гена Iswi затрагивают преимущественно структурную организацию Х-хромосомы у самцов

^{У самцов дикого типа Х-хромосома по своему общему виду сходна с плечом аутосомы (перепечатано, с любезного разрешения, из. Deuring et al., 2000 [©Elsevier])}

Совершенно иной хромосомный фенотип наблюдается тогда, когда имеет место сверхэкспрессия белка гетерохроматина, SU(VAR)3—7 (Delattre et al., 2004). Белок SU(VAR)3—7 является структурным компонентом гетерохроматина, который ко-локализуется с НР1 (heterochromatin protein 1) и с метилтрансферазой лизина гистонов (НКМТ) SU(VAR)3-9 (глава 5). Хотя сверхэкспрессия Su(var)3—7 вызывает морфологические эффекты в хромосомах и самцов, и самок, Х-хромосома самцов затрагивается в наибольшей степени, поскольку она приобретает очень маленькие размеры и высоко-компактизированный вид.

Странно, что политенная Х-хромосома самцов более чувствительна, чем другие хромосомы, к изменениям в балансе компонентов хроматина с положительными либо отрицательными эффектами. Важным механизмом поддержания наследуемых состояний хроматина может быть конкуренция за повторную сборку [reassembly] факторов после синтеза ДНК. Возможно, гиперактивная политенная Х-хромосома самцов, в силу ее открытого в норме состояния, действует как ведущий индикатор, когда изменяется естественный баланс ключевых факторов, модулирующих хроматин (Lucchesi et al., 2005).

6. Перспективы

С ростом использования технологий микрочипов [microarray technologies] мы начинаем определять точный паттерн связывания комплекса MSL в масштабах всего генома и отличительные особенности генов, которые он регулирует (Alekseyenko et al., 2006; Gilfillan et al., 2006; Legube et al., 2006). Эти сведения несомненно приведут к лучшему пониманию того, каким образом этот комплекс «нацеливается» на Х-хромосому Понимание такого «нацеливания» должно, в свою очередь, помочь нам идентифицировать механизмы, с помощью которых комплекс MSL увеличивает экспрессию генов. Недавно полученные результаты показали, что кодирующие районы генов, а не регуляторные районы «вверх по течению», связываются комплексом MSL, что видно по H4K16ас на избранных генах. В этих результатах находит ключевую поддержку модель, согласно которой компенсация дозы происходит путем регулирования скорости транскрипционной элонгации и рециклирования РНК (Smith et al., 2001).

Полное выяснение молекулярного механизмка, ответственного за компенсацию дозы, потребует точного определения влияния комплекса MSL на общий механизм транскрипции. Белки MSL и РНК roX, по-видимому, предназначены для компенсации дозы, поскольку ни один из этих компонентов не требуется для жизнеспособности самок. Тем не менее, возможно, что многие дополнительные факторы способствуют компенсации дозы, но являются существенными и у самцов, и у самок в силу их общих ядерных, хромосомных или транскрипционных функций (Mendjan et al., 2006). В предстоящие годы идентификация этих факторов будет иметь очень большое значение для понимания биохимических основ двукратного увеличения экспрессии сцепленных с Х-хромосомой генов, наблюдаемого у самцов Drosophila. В конечном счете, понимание компенсации дозы даст ключевую информацию относительно организации хроматина в транскрипционные домены у высших организмов и позволит глубже проникнуть в молекулярные механизмы тонкой настройки наследуемой экспрессии генов в точных пределах.

Литература

Aasland R. and Stewart A.F., 1995. The chromo shadow domain, a second chromo domain in heterochromatin-binding protein 1, HP1. Nucleic Acids Res. 23: 3168–3173.

Akhtar A. and Becker P.B., 2000. Activation of transcription through histone H4 acetylation by MOF, an acetyltransferase essential for dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell 5: 367–375.