Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

6*. Какое увеличение вы видите в микроскоп при использовании объектива 100х?

*Дополнительные вопросы.

Лабораторная работа 9. Световая микроскопия срезов тканей. Органеллы: аппарат Гольджи двух типов, диффузный и сетчатый, и митохондрии

Цель работы

Изучить органеллы, участвующие в синтезе и транспорте веществ, а также в энергетическом обмене (комплекс Гольджи и митохондрии).

Введение

Практически для всех клеточных органелл существуют специфические красители, используемые для их визуализации при помощи световой микроскопии. Большая часть методов имеют близкие модификации как для окрашивания клеток, так и для срезов тканей. Например, для окрашивания митохондрий можно применить метод Альтмана – один из самых старых способов окраски митохондрий. Для этого используют осмиевую фиксацию, которая хорошо сохраняет липиды. Затем окрашивают кислым фуксином Альтмана (20 %-ный раствор кислого фуксина в насыщенном водном растворе анилина). Избыток красителя удаляют, споласкивая спиртовым раствором пикриновой кислоты. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а митохондрии – в ярко розовый.

В цитоплазме окрашенных по Альтману клеток можно найти скопления мелких зерен или коротких палочек, окрашенных в розово-красный цвет, – это митохондрии. Стоит отметить, что даже при максимально возможном разрешении световой микроскопии внутреннее устройство митохондрий плохо различимо. Для более детального молекулярно-биологического анализа необходимы методы флуоресцентной и электронной микроскопии, а также их сопряжение с методами иммуноокрашивания.

Аппарат Гольджи – мембранный органоид, который представляет собой совокупность плоских мембранных мешочков (цистерн), организованных в стопки. Он является важным компонентом системы внутриклеточного транспорта, участвуя в модификации, сортировке, упаковке и транспортировке белков и липидов, синтезируемых в эндоплазматическом ретикулуме.

Классическая организация аппарата Гольджи предполагает наличие цис-сети (или цис-стороны), медиальных цистерн и транс-сети (или транс-стороны). Цис-сеть – это первый отдел аппарата Гольджи, куда поступают транспортные везикулы с белками и липидами от эндоплазматического ретикулума. Медиальные цистерны – это промежуточные компартменты, где происходят основные процессы модификации белков и липидов, включая гликозилирование (присоединение углеводных остатков) и сульфатирование. Транс-сеть – конечный отдел, обращенный к плазматической мембране, в котором белки и липиды претерпевают окончательную модификацию, сортируются и упаковываются в везикулы для дальнейшего транспорта к месту назначения (плазматическая мембрана, лизосомы или секреторные гранулы).

Выделяют классический (или сетчатый) и диффузный типы организации аппарата Гольджи. Сетчатый тип представляет собой одну крупную централизованную структуру, локализованную вблизи ядра клетки. Он чаще всего встречается в клетках животных, особенно в клетках с выраженной секреторной активностью. Аппарат Гольджи этого типа обычно располагается в перинуклеарной области, рядом с эндоплазматическим ретикулумом и центросомами. Его ориентация может быть поляризована, например, в эпителиальных клетках, где цис-сторона обращена к эндоплазматическому ретикулуму, а транс-сторона – к плазматической мембране. Сетчатый тип аппарата Гольджи эффективен для клеток, активно участвующих в секреции белков, липидов и других макромолекул. Например, клетки поджелудочной железы и плазматические клетки, которые секретируют большие объемы белков, обладают крупными, компактно расположенными комплексами Гольджи.

Диффузный тип аппарата Гольджи характеризуется распределением его структур по объему цитоплазмы клетки. В этом случае аппарат Гольджи не образует одну крупную и локализованную структуру, а представлен в виде множественных дискретных комплексов, рассеянных по клетке. Диффузный тип чаще всего встречается в клетках растений, а также в некоторых специализированных клетках животных, например, в таких, которые подвергаются значительным изменениям формы или размера (мигрирующие клетки, клетки иммунной системы, нейрональные клетки). Диффузный тип обеспечивает более широкий охват клеточных областей, что может быть полезно для быстрого внутриклеточного транспорта веществ на большие расстояния. Например, в нейронах такой тип позволяет транспортировать вещества в отдаленные участки аксонов или дендритов. В клетках растений множество мелких структур аппарата Гольджи (диктиосом) обеспечивают распределенную секрецию веществ, в частности, для синтеза клеточной стенки.

Аппарат Гольджи сложно наблюдать с помощью обычного светового микроскопа без специальных красителей. Однако в клетках с хорошо развитым секреторным аппаратом комплекс Гольджи можно увидеть как светлую зону вблизи ядра, так называемую «перинуклеарную зону Гольджи». Для улучшения визуализации используют специфические красители или антитела против белков Гольджи, помеченные флуоресцентными метками. Окрашивание цитоплазматических структур серебрением/золочением позволяет проявить серо-желтые структуры, соответствующие аппарату Гольджи.

Материалы и оборудование

• Световой микроскоп с набором объективов 40х–100х.

• Набор готовых препаратов.

• Иммерсионное масло.

• Жидкость для очистки стекол, салфетки.

• Карандаш, блокнот для рисунков.

Поставленные задачи

1. Ознакомиться с описанием используемых препаратов (см. Приложение, табл. 2).

2. Изучить органеллы, участвующие в синтезе и транспорте веществ. При малом (40х) и большом (100х) увеличении в клетках отметить цитоплазму и комплекс Гольджи.

3. Рассмотреть митохондрии. Отметить при большом (100х) увеличении клеточные ядра и митохондрии в цитоплазме.

Ход работы

1. Подготовить микроскоп к работе: убедиться, что карусель опущена, включить подсветку.

2. Поместить слайд на предметный столик микроскопа.

3. При опущенной карусели объективов повернуть необходимый объектив 40х, подобрать фокусное расстояние.

4. Найти ядро, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Зарисовать микрокартину ткани с несколькими клетками.

5. При опущенной карусели повернуть объектив 100х в положение для микроскопии. Нанести иммерсионное масло на стекло при смене объектива на 100х.

6. Подобрать фокусное расстояние.