Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

В митотических хромосомах человека и Drosophila субдомены CENP-A сливаются, образуя трехмерную цилиндрическую структуру, в значительной мере исключающую нуклеосомы H3 (Blower et al., 2002). Блоки нуклеосом CENP-A ориентированы на поверхности хромосом, направленной к полюсам, а блоки нуклеосом H3 локализованы по направлению к внутреннему району хроматид. Внутренние и внешние белки кинетохора обернуты вокруг цилиндра CENP-A; это трехмерное расположение согласуется с CENP-A, играющим центральную роль в рекрутировании других кинетохорных белков (Blower et al., 2002). Для того чтобы согласовать двумерное чередование блоков CENP-Аи H3 (рис. 14.66 и 14.76) с разделением в трехмерных митотических хромосомах, предположили, что CEN-ДНК может закручиваться спиралью или выпетливаться в цилиндрической структуре, приводя к выравниванию нуклеосом с одним и тем же составом по одной линии [alignment] или в стопку (рис. 14.7в). Таким образом, раздельно модифицированные перемежающиеся нуклеосомы H3 и фланкирующий гетерохроматин могли бы отвечать за сборку трехмерной структуры CEN-хроматина в митозе (Sullivan and Karpen, 2004). Такое расположение может быть необходимо, чтобы экспонировать хроматин CENP-A внешней стороне хромосомы, где он может рекрутировать кинетохорные белки таким образом, который устанавливает правильную двойную ориентацию сестринских кинетохоров по отношению к полюсам веретена.

3.4. Модели структуры, функции и воспроизведения центромеры

Ключевым вопросом, исследуемым в настоящее время, является вопрос о том, как CENP-A и другие эпигенетические маркеры специфически локализуются и воспроизводятся в центромерах. Другой подход к этому же вопросу заключается в том, чтобы рассмотреть, каким образом CENP-A собирается только в центрмерном хроматине. Одна из привлекательных моделей предполагает, что включение CENP-A специфически в центромеры регулируется дифференциальными сроками и репликации CEN-ДНК, и экспрессии CENP-A по сравнению с основной массой хроматина (Ahmad and Heniloff, 2001). Однако репликация CEN-ДНК у человека и мух происходит на протяжении всей фазы S, одновременно с репликацией основной ДНК (Shelby et al., 2000; Sullivan and Karpen, 2001), а включение CENP-A происходит в отсутствие репликации ДНК (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). Эти наблюдения исключают механизм строгой привязки ко времени репликации для воспроизведения CENP-A и центромерной идентичности.

Более привлекательный механизм вытекает из интригующего наблюдения, согласно которому CENP-A активно инкорпорируется в нуклеосомы не зависящим от репликации образом с помощью комплекса обмена гистонов (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). H3.3 является вариантом H3, сборка которого, не зависящая от репликации (Ahmad and Heniloff, 2002), опосредуется комплексом, известным как регулятор гистонов A (HIRA), а не комплексами фактора сборки хроматина (CAF, chromatin assembly factor), ответственными за зависимое от репликации включение канонических нуклеосом H3 (Nakatani et al., 2004). У S. cerevisiae устранение компонентов HIRA приводит к неправильной локализации CENP-A (Sharp et al., 2002). Однако в настоящее время неясно, влияют ли компоненты HIRA на центромерный хроматин у многоклеточных эукариот или у S. pombe, где центромерная идентичность определяется эпигенетически. Более важно, что эти белки играют роль в сборке и структуре хроматина, например путем откладки H3.3; таким образом, широкая активность идентифицированных компонентов HIRA не объясняет специфичности включения CENP-A в центромеры. Возможно, что некая подгруппа комплексов HIRA содержит факторы, взаимодействующие только с CENP-A и распознающие существующие нуклеосомы CENP-A в реплицированном хроматине CEN; однако никаких таких факторов специфичности идентифицировать не удалось. Один из способов согласовать участие неспецифических факторов сборки — это представить себе, что специфичность обеспечивается CENP-A или нуклеосомами CENP-A. Например, определенные структурные взаимоотношения между CENP-A и Н4 могли бы обеспечить специфичность сборки новой CENP-A в центромерах; на эту мысль наводит способность взаимодействующего домена «нацеливать» CENP-A на центромеры (Black et al., 2004). Неясно, однако, достаточны ли эти домены для «нацеливания» центромер в отсутствие эндогенной CENP-A.

Сейчас очевидно, что требуется по-новому представлять себе эпигенетическую регуляцию центромерной идентичности и воспроизведения. У S. cerevisiae результатом дефектов в протеолизе CENP-A оказывается неправильное включение в нецентромерные в норме районы, что в норме удаляется неизвестным механизмом «очищения» отовсюду, кроме эндогенной центромеры (Collins et al., 2004). Это позволяет предполагать, что центромерная идентичность может регулироваться после сборки нуклеосом. Однако неправильная локализация CENP-A у мух приводит к эктопическому формированию кинетохора (Heun et al., 2006), заставляя предполагать, что удаление неправильно включенного CENP-A может быть специфичным для S. cerevisiae.

Тем не менее, вариации такой модели «негативной специфичности» стоит рассмотреть. Ключевой вопрос для всех моделей центромерной идентичности заключается в следующем: что обеспечивает специфичность? В данном случае, почему такие белки, как CENP-A, должны сохраняться только в одном сайте? Одна новая идея возникает в связи с тем фактом, что стабильная ассоциация с веретеном является тем свойством, которое уникально для функциональных центромер, кинетохоров (Mellone and Allshire, 2003). Таким образом, воспроизведение центромеры и сайт включения CENP-A могут определяться в ходе митоза, с помощью механизма, чувствующего продуктивные прикрепления кинетохора и веретена, или опосредованное веретеном натяжение. Другая идея, которую стоит рассмотреть, заключается в том, что паттерн модификации перемежающихся нуклеосом H3 белками, модифицирующими гистоны (т.е. ацетилтрансферазами, метилтрансферазами и киназами), может помогать воспроизводить центромерную идентичность вместо ассоциированных с CENP-A белков (или в дополнение к ним) (Sullivan and Karpen, 2004). По-разному модифицированные перемежающиеся субдомены H3 (рис. 14.7) могли бы создавать «пермиссивную» структуру хроматина, необходимую для сборки новой CENP-A.

Идентификация факторов, требующихся для помещения CENP-A в центромеры, независимо от конкретной модели, является стратегией, которая, вероятно, обеспечит новое понимание. Биохимические и генетические исследования позволили идентифицировать некоторые из них как влияющие на сигналы CENP-A в центромерах, включая ранее известные факторы, участвующие в не зависящей от хроматина сборке хроматина. Однако ни один из идентифицированных до сих пор факторов не взаимодействует специфическим образом с CENP-A или другими белками центромерного хроматина или модификациями. Тем не менее, удивительно, что факторы все же идентифицируются, и должно скоро последовать выяснение специфических механизмов.

3.5. Эпигенетика и эволюция центромер

При том значении, которое центромеры имеют для клетки и жизнеспособности организма, не может быть и речи о приобретении или утрате центромерной функции. Тогда почему же центромеры используют эпигенетические механизмы регуляции, если существенным преимуществом для отдельной клетки и организма в целом было бы иметь центромеры «зашитыми» в первичную нуклеотидную последовательность ДНК?

Можно возразить, что эпигенетическая регуляция центромерной идентичности необходима для подгонки к изменениям, происходящим в ходе эволюции с хромосомами, нуклеотидными последовательностями и белками. Исследования на млекопитающих (например, приматах и сумчатых), насекомых и организмах других таксонов показали, что приобретение и утрата центромер являются характерными событиями в эволюции хромосом (Ferreri et al., 2005). Родственные виды часто различаются расположением и ассоциацией хромосомных плеч, даже в тех случаях, когда нуклеотидные последовательности ДНК почти идентичны. Эти приобретения и утраты центромер часто сопровождают транслокации и другие перестройки и, вероятно, поддерживаются ими. Например, потребность в одной, и только в одной, центромере делала бы многие из получающихся в результате дицентрических и ацентрических хромосомных перестроек бесполезными, если бы центромеры не могли инактивироваться, а неоцентромеры— активироваться (рис. 14.8а). Таким образом, способность перемещать центромеры из одной нуклеотидной последовательности ДНК в другую путем распространения, перескакивания или активации может ускорять эволюцию хромосом. Кроме того, в ходе эволюции в высокоповторяющихся сателлитных последовательностях очень часто происходят наращивания, сокращения и замены оснований и они могут быть связаны с изменениями в локализации центромер (рис. 14.86). Центромеры растений в особенности демонстрируют в ходе эволюции быстрые и значительные изменения в нуклеотидных последовательностях ДНК и в локализации (Hall et al., 2006). Неясно, однако, вызывают ли изменения ДНК перемещения центромер, или они происходят в ответ на перемещения центромер, или же и те и другие полностью независимы. Тем не менее, должен существовать механизм поддержания функции и воспроизведения центромер, не зависимый от изменений нуклеотидных последовательностей, и такой механизм обеспечивает эпигенетическая регуляция.

Сравнение аминокислотных последовательностей у центромерных белков разных видов привело к предположению, что домены, связанные с CEN-ДНК, «коэволюируют», чтобы приспособиться к изменениям в сателлитных последовательностях (Malik and Henikoff, 2002; см. также главу 13). Интересный компонент этой модели предполагает, что эти изменения стимулируются «мейотическим драйвом» — явлением аллельного отбора (а по умолчанию, отбора целой хромосомы), происходящего во время мейоза. Так, центромера, обладающая самым высоким сродством к белкам CEN-хроматина, достигает наибольшего успеха во включении в функциональные зародышевые клетки (т.е. в ооцит, а не в полярное тельце в случае женского мейоза) (см. другие примеры мейотического драйва в разделе 5). Это, в свою очередь, могло бы принуждать другие центромеры к тому, чтобы приспосабливаться к тем же вариантам нуклеотидных последовательностей и белков, чтобы эффективно расходиться.

Утрата такой эпигенетической метки, как CENP-A, дает другой механизм для инактивации центромеры без делеции центромерной ДНК, как показывают последствия обеднения CENP-A у многочисленных организмов (Cleveland et al., 2003). Идентификация механизмов приобретения центромеры является большим вызовом, поскольку она требует приобретения эпигенетической метки в отсутствие изменений в нуклеотидных последовательностях ДНК. Исследования экспериментально индуцированных центромер у мух позволяют предположить один такой молекулярный механизм для приобретения центромеры — за счет cis-распространения таких ключевых белков центромерного хроматина, как CENP-A (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001). Однако эта модель не может объяснить формирование неоцентромер у человека или большинство примеров приобретения центромеры в эволюции, которое может происходить на больших расстояниях от родительской центромеры. Возможно, механизм, более соответствующий этим случаям приобретения центромеры, включает неправильную локализацию CENP-A в ответ на преходящую сверхэкспрессию, приводя к формированию эктопических кинетохоров, как это наблюдали в опытах на мухах (Heun et al., 2006). Сверхэкспрессию CENP-A наблюдали в опухолях прямой кишки и груди, заставляя предполагать потенциальную связь с массивной нестабильностью генома, наблюдаемую при раке. Для прямой проверки этой гипотезы, а также ее роли в эволюции центромер необходимы дальнейшие исследования преобладания неправильной локализации CENP-A в различных типах рака у человека и сроков этой неправильной локализации в ходе инициации и прогрессии рака.

Рис. 14.8. Эволюция хромосом и эпигенетическая регуляция центромерной идентичности

^{Пластичность центромер в отношении ассоциации со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК может быть нужна для приспособления к тем изменениям нуклеотидных последовательностей и хромосомным перестройкам, которые происходят в ходе эволюции, (а) Транслокации, часто наблюдаемые в ходе эволюции, могут создавать ацентрические и дицентрические хромосомы; и те, и другие в норме теряются при митотических или мейотических делениях Эпигенетическая регуляция и пластичность позволяют ацентрическим фрагментам приобрести неоцентромерную функцию, так же как инактивация одной центромеры в дицентрической хромосоме, что приводит к нормальному наследованию обоих продуктов транслокации (В.Р. = точки разрывов при транслокации). (б) У большинства эукариот центромеры погружены в гетерохроматин и повторяющиеся ДНК, особенно в высокоповторяющиеся сателлитные последовательности. В ходе эволюции эти последовательности изменяются с огромной частотой и претерпевают частые замены оснований, а также приращения и сокращения. Строгая зависимость центромерной идентичности от специфических нуклеотидных последовательностей ДНК приводила бы к утрате функций центромеры и кинетохора и к пагубной потере хромосомы. Напротив, эпигенетическая регуляция идентичности и локализации центромеры обеспечивает механизм поддержания центромер несмотря на изменения нуклеотидных последовательностей}

Наконец, первые центромеры могли бы быть представлены голоцентрическими хромосомами; формирование кинетохоров могло бы вначале развиваться со случайной специфичностью в отношении нуклеотидной последовательности, за чем могла следовать эволюция моноцентрических хромосом, возникающих благодаря инвазии транспозонов, экспансии сателлитной ДНК и формированию фланкирующего гетерохроматина.

Однако возможно также, что голоцентрические хромосомы развились из моноцентрических хромосом благодаря утрате гетерохроматиновых граничных элементов и as-распространению центромерного хроматина, примерно так же, как это происходит при возникновении неоцентромер у Drosophila (Maggert and Karpen, 2001).

4. Гетерохроматин и мейотическое спаривание / расхождение

Меотический процесс у большинства организмов охватывает (1) спаривание, которое выравнивает гомологи относительно друг друга; (2) синапсис, которое соединяет гомологи структурой, известной как синаптонемный комплекс (SC); (3) рекомбинацию, которая физически сцепляет гомологичные хромосомы и осуществляет обмен генетической информацией; (4) расхождение гомологов к противоположным полюсам в мейозе I и (5) разделение сестринских хроматид в мейозе II (рис. 14.9). Такие гетерохроматиновые элементы, как центромеры и теломеры, играют важную роль в контроле положения рекомбинационных событий в эухроматине; и наверняка гетерохроматиновые элементы (в особенности центромера) играют критическую роль в расхождении Более того, многочисленные недавние исследования убедительно свидетельствуют, что модификации гистонов и, возможно, другие эпигенетические компоненты и процессы играют критическую роль в облегчении мейотического процесса. Например, белок HIM-17 у С. elegans, который нужен для метилирования H3K9, необходим для формирования DSBs, инициирующих рекомбинацию (Reddy and Villeneuve, 2004). Аналогичным образом, для инициации DSBs у S. pombe требуется киназа гистонов (Ogino et al., 2006). Метилирование гистонов также необходимо, чтобы сделать мейотические хромосомы компетентными к завершению мейотических делений у Drosophila (Cullen et al., 2005; Ivanovska et al., 2005) и млекопитающих (De La Fuente, 2006).

Рис. 14.9. Механистическое представление мейотического процесса

^{Пара гомологичных хромосом во время первого мейотического деления должна совершить три вещи. Во-первых, гомологи должны спариться по всей своей длине. Практически у всех организмов кульминацией этого спаривания является интимная ассоциация, при которой эти гомологи соединены вдоль всей своей длины синаптонемным комплексом. Это состояние называется синапсисом. Во-вторых, практически у всех организмов гомологичные хромосомы соединяются вместе рекомбинацией, называемой также кроссинговером. События обмена (кроссоверы) формируют структуры, называемые хиазмами, которые физически соединяют хромосомы друг с другом посредством сестринской хроматиды, представленной на каждом гомологе на обеих сторонах кроссоверного события. Как спаривание, так и рекомбинация происходят во время профазы (до разрушения ядерной оболочки). Третье важное событие, расхождение (сегрегация), происходит на MI-веретене, которое создается после разрушения ядерной оболочки. В ходе ранних стадий сборки веретена (прометафаза) хромосомы собираются вместе и образуют метафазную пластинку. У большинства животных самцы содержат центриолярные мейотические веретена, тогда как у самок большинства животных веретено ацентриолярно. В этом случае сами хромосомы образуют массу, на месте которой в конечном счете формируется метафазная пластинка, и организуют вокруг нее биполярное веретено. Коль скоро хромосомы должным образом совместно ориентированы (т.е. уравновешены в метафазной пластинке гомологичными кинетохорами, прикрепленными к противоположным полюсам веретена), ряд механизмов включают начало анафазы. В анафазе соединение (когезия) сестринских хроматид ослабляется вдоль плеч (но не возле центромер). Это растворяет связи, называемые хиазмами и созданные кроссоверами, и таким образом дает гомологам возможность разделиться и отойти к противоположным полюсам в анафазе I. Мейоз II в основе своей является гаплоидным митозом, который происходит и без репликации, и без рекомбинации}

Хотя использование рекомбинации для обеспечения расхождения мейотических хромосом является почти универсальным, существуют также мейотические системы, в которых ассоциации гомологов могут устанавливаться без рекомбинации (т.е. так называемые ахиазматические мейотические системы). В таких системах гетерохроматиновые спаривания и, возможно, другие субстраты для эпигенетических модификаций оказываются играющими критическую роль. Это в особенности верно в отношении самок и самцов Drosophila melanogaster, но может быть верным и по отношению к дрожжам. Наконец, известны многие системы мейотического драйва — например, благоприятствование одной из аллелей в ходе мейотической сегрегации, — в которых модификация специфических гетерохроматиновых элементов вызывает или делает возможной последующую утрату инактивации специфической хромосомы или целого хромосомного набора.

4.1. Обнаружение сайта гетерохроматинового спаривания у самцов Drosophila

Первым доказательством существования гетерохроматинового элемента, опосредующего спаривание и расхождение гомологов, была идентификация структур в перицентромерном гетерохроматине, опосредующих спаривание и расхождение ахиазматических пар половых хромосом в сперматогенезе у самцов Drosophila. Было показано, что эти структуры, известные как коллохоры, соответствую! повторам рДНК; было показано, что интеграция генов рДНК в лишенные коллохоров Х-хромосомы восстанавливает спаривание Х-Y в сайте вставки рДНК (McKee, 1998). Ключевым сегментом повтора рДНК в отношении спаривания является повторяющаяся последовательность длиной 240 п.о. в межгенном спейсере. Когда эта последовательность в 240 п.о. присутствует во многих копиях, она облегчает спаривание и последующее расхождение хромосом X и Y в мейозе у самцов Drosophila. Хотя степень, с которой гетерохроматиновые ассоциации в сперматоцитах Drosophila облегчают эухроматиновое спаривание, остается открытым вопросом, ниже мы обсудим ряд наблюдений, позволяющих предполагать, что неспособность опосредовать или поддерживать спаривание приводит, оказывается, к неправильной активации или инактивации гетерохроматина. Результатом такого события часто оказываются нарушения сперматогенеза (McKee, 1998).

4.2. Спаривание гетерохроматина облегчает расхождение у самок Drosophila

Имеются два главных механизма для обеспечения расхождения (сегрегации) гомологов у самок Drosophila: система хиазм, которая опосредует расхождение гомологов, которые подверглись кроссинговеру, и ахиазматическая система, которая обеспечивает расхождене тех пар гомологов. которые не претерпели кроссинговер. Например, мелкие точечные четвертые хромосомы никогда не претерпевают кроссинговер, и тем не менее они расходятся друг с другом во время мейоза с очень высокой степенью надежности. Цитологические и генетические эксперименты показали, что для ахиазматического спаривания и расхождения необходим гетерохроматин. Спаривание гомологичных гетерохроматиновых участков ахиазматических хромосом поддерживается начиная с ранней профазы и до того момента, когда ахиазматические гомологи начинают отделяться от своих партнеров в прометафазе I (рис. 10) (Dernburg et al., 1996). Более того, опыты с использованием делеций показали, что гомологичная ахиазматическая сегрегация у Drosophila полностью зависит от гетерохроматиновых гомологий (Hawley et al., 1993; Karpen et al., 1996). Все еще неясно, является ли способность опосредовать эти события спаривания и расхождения общим свойством гетерохроматиновых последовательностей или белков хроматина или же результатом ряда специфических участков, диспергированных в гетерохроматине.

4.3. Роль центромеры в облегчении ахиазматической сегрегации у почкующихся дрожжей

Хотя фланкирующие гетерохроматиновые районы, по-видимому, достаточны для того, чтобы опосредовать ахиазматическую сегрегацию у самок Drosophila, кажется вероятным, что у почкующихся дрожжей одни только центромерные последовательности могут быть способны играть эту роль. Дин Даусон (Dean Dawson) и его сотрудники проанализировали мейоз у дрожжей, несущих пару гомеологичных (т.е. частично гомологичных) хромосом, происходящих от разных видов дрожжей (Kemp et al., 2004). Несмотря на тот факт, что эти хромосомы несут сходные наборы генов, они дивергировали в достаточной степени, чтобы между ними не происходил кроссинговер; тем не менее, они надежно расходились. Хотя плечи этих гомеологичных хромосом соединяются друг с другом во время профазы мейоза не чаще, чем плечи гетерологичных хромосом, эти гомеологичные хромосомы, тем не менее, обнаруживают высокую степень центромерного спаривания (Kemp et al., 2004). Более того, это спаривание уменьшается в присутствии третьей безобменной хромосомы, даже если она несет другой центромерный участок; это заставляет предполагать, что центромерное спаривание действительно является независимым от последовательности.