Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Участие метилирования аргининов предполагают как в позитивной, так и в негативной регуляции транскрипции. Две метилтрансферазы, PRMT1 (protein arginine methyl-transferse) и PRMT4/CARM1, были связаны с активацией транскрипции. PRMT1 обладает способностью метилировать H4R3 (Strahl et al., 2001; Wang et al., 2001), тогда как PRMT4/CARM1 может катализировать метилирование H3R2, H3R17 и H3R26 (Schurter et al., 2001; Bauer et al., 2002). Специфические транскрипционные факторы (NR, p53, YY1, NFKB) рекрутируют эти ферменты к специфическим промоторам, где они активируют транскрипцию. Напротив, PRMT5 (которая может метилировать H3R8 и H4R3) действует как репрессор многочисленных генов, в том числе некоторых генов, регулируемых МУС (Fabbrizio et al., 2002; Pal et al., 2003).

Большинство наших сведений о метилировании аргининов мы получаем при анализе эстрогенного сигнального пути, регулирующего ген pS2. ChlPs показали, что вслед за стимуляцией этого гена эстрогеном происходит сложная и цикличная последовательность событий.Сначала, в течение ближайших после стимула минут, рецептор эстрогена рекрутируется к промотору pS2 и приносит с собой много белковых комплексов и энзимов, которые модифицируют гистоны (Metivier et al., 2003). Важным здесь оказывается рекрутирование CARM1 и PRMT1, которые могут метилировать аргининовые остатки гистонов H3 и Н4 (Ма et al., 2001; Bauer et al., 2002). Это метилирование выявляется очень скоро после прибытия энзимов и совпадает с появлением активной RNA pol II на промоторе. Удивительно однако, что уже спустя минуты после этих событий метилирование по аргининам больше не обнаруживается специфическими антителами, a RNA pol II исчезает. Вскоре после этого метилирование аргининов и RNA pol II появляются вновь (Metivier et al., 2003; Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Причины этих циклических событий неизвестны. Одна из возможностей заключается в том, что они представляют собой механизм быстрого отключения транскрипции, если эстрогеновый сигнал исчезает.

Эксперименты, проделанные на реконструированных хроматиновых матрицах, помогли установить прямую роль метилирования аргининов в экспрессии генов. Анализ опосредованной р53 активации транскрипции in vitro показал, что имеет место синергизм между метилированием, обусловленным PRMT1 и CARM1, и ацетилированием с помощью СВР/р300 (An et al., 2004). Более того, эти тесты подтвердили наблюдения, сделанные in vitro на гене pS2, согласно которым во время активации имеет место специфический порядок событий, в ходе которых необходима последовательная активность PRMT1, СВР/р300 и С ARM! (Metivier et al., 2003).

С учетом того, что метилирование аргининов представляет собой такой динамический процесс, были описаны несколько способов, которыми контролируется эффективность метилтрансферазы аргининов. Во-первых, взаимодействие этого фермента с другим белком может контролировать его субстратную специфичность. Во-вторых, имеется возможность конкуренции между энзимами за данный аргининовый субстрат. И PRMT1, и PRMT5 могут метилировать H4R3, но первый фермент является активатором, а второй — репрессором транскрипции. Третий уровень регулирования метального состояния может осуществляться деметилированием аргининов. Такая активность все еще не была выделена, но имеются четкие свидетельства быстрого исчезновения метальных групп из аргининов, что делает такую активность весьма привлекательной возможностью (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005; Wysocka et al., 2006a).

5. Деиминирование

Отсутствие деметилазы аргининов навело на мысль, что в качестве антагонистов метилирования аргининов могут выступать другие типы ферментативных реакций (Bannister et al., 2002). Одну из таких реакций представляет деиминирование — процесс, посредством которого аргинин может быть превращен в цитруллин за счет удаления иминогруппы. Если данный аргинин моно-метилирован, удаление метиламина эффективно приводило бы к удалению метильной группы из аргинина. В настоящее время показано присутствие цитруллина в гистонах, и идентифицирован фермент, PADI4, который может превращать аргинины в составе гистонов в цитруллины (Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Более того, появление цитруллина в гистонах H3 и Н4 коррелирует с исчезновением метилирования аргинина in vivo. Кроме того, анализ регулируемых эстрогеном промоторов, где метилирование аргининов совпадает с активным состоянием транскрипции, показал, что цитруллин появляется, когда промотор выключен. Многие вопросы относительно этой модификации остаются без ответа. Действует ли цитруллин таким образом, что подавляет активное метилирование по аргининам, или же он репрессирует транскрипцию путем активного рекрутирования белков? Как обстоит дело с обратимостью вставки цитруллина? Это несомненно происходит на промоторах с очень высокой скоростью, но есть ли это ферментативно катализируемая реакция или же это просто обусловлено замещением нуклеосомных гистонов гистоновыми вариантами, которые содержат аргинин на месте цитруллина?

6. Убиквитилирование/ деубиквитилирование и сумоилирование

Убиквитин и SUMO — совершенно иные PTMs по сравнению с ацетилированием, фосфорилированием и метилированием. В то время как эти последние PTMs представляют собою малые химические группы, Ub и SUMO — это крупные полипептиды, которые увеличивают размеры гистона приблизительно на две трети. Ub и SUMO на 18 % идентичны по нуклеотидной последовательности и имеют общую трехмерную структуру, но различаются по поверхностному заряду.

Гистоны были первыми белками, для которых было показано, что они моноубиквитилированы, хотя точное положение Ub не было идентифицировано до сравнительно недавнего времени (Robzyk et al., 2000; Wang et al., 2004). Подобно метилированию и в отличие от ацетилирования и фосфорилирования (и, возможно, сумоилирования) убиквитилирование может быть либо репрессивным, либо активирующим в зависимости от специфических сайтов. Н2А и Н2В моноубиквитилированы, что контрастирует с полиубиквитилированием, ассоциированным с протеолизом. Влияние моноубиквитилирования на каждый коровый гистон противоположно (рис. 10.7). Моноубиквитилирование Н2В является активирующим для транскрипции, преобразованной RNF20/RNF40 + UbcH6) (Wood et al., 2003; Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005), и ведет к метилированию H3K4, как описано в предыдущем разделе и в следующем разделе (Henry et al., 2003; Као et al., 2004). Эта последовательность событий, хотя пока еще непонятная в механистическом плане, консервативна от дрожжей до человека (Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005). С другой стороны, у млекопитающих H2AK119ubl является репрессивным для транскрипции и катализируется белком В mi 1/Ring 1 из группы Polycomb (Wang et al., 2004). Нет никаких данных в пользу эволюционного консерватизма репрессивного H2Aub у дрожжей.

До сих пор не идентифицирован ни один специфичный для гистонов белок, связывающий убиквитин. Однако поскольку было документировано, что многочисленные домены взаимодействия с убиквитином связываются с негистоновыми убиквитилированными субстратами, кажется весьма вероятным, что будут обнаружены эффекторы для убиквитилированных гистонов. Однако они могут взаимодействовать иным образом, чем взаимодействующие с хроматином домены для ацетилирования и метилирования; т.е., вероятно, имеются два типа одновременных связывающих взаимодействий; одно с поверхностью на убиквитине и другое взаимодействие внутри гистоновых последовательностей для обеспечения специфичности взаимодействия.

Деубиквитилирование сайта H2BK123 участвует и в активации, и в поддержании гетерохроматинового сайленсинга через действие двух различных протеаз, Ubp8 и UbplO. Ubp8 является субъединицей комплекса ацетилирования гистонов, SAGA (Sanders et al., 2002), и действует вслед за убиквитилированием, производимым Rad6 (Henry et al., 2003; Daniel et al., 2004). Эта последовательность убиквитилирования H2B, за которым следует деубиквитилирование, необходима для установления соответствующих уровней метилирования H3K4 (требуется H2Bub) и H3K36 (H2Bub не требуется) (Henry et al., 2003). UbplO функционирует в «молчащих» районах, поддерживая низкие уровни H3K4me и ацетилирования лизинов H3/Н4, и таким образом помогает предотвращать транскрипцию (Emre et al., 2005; Gardner et al., 2005).

Рис. 10.7. Сайты убиквитилирования гистонов и его последствия для регулирования транскрипции

^{Убиквитилирование Н2А по Lys-119 коррелирует с репрессией транскрипции. Убиквитилирование H2BK123, наоборот, связано с активацией транскрипции}

Сумоилирование является единственной НРТМ, описанной у дрожжей в качестве репрессивной, и оно консервативно у млекопитающих (Shiio and Eisenman, 2003). Его роль может сводиться, в целом, к негативному действию по предотвращению действия активирующих HPTMs. Это подавление активных HPTMs может осуществляться двумя механизмами. Во-первых, SUMO-гистон может прямо блокировать лизиновые сайты-субстраты, которые могут ацетилироваться или же сумоилироваться (как в модели 2 на рис. 10.1). Во-вторых, сумоилированные гистоны могут рекрутировать HDACs как к хроматину (модель 3), так и через группу SUMO, которая оказывается на связанных с ДНК репрессорах.

7. Темы в модификациях

Предшествовавшее обсуждение многочисленных типов и сайтов гистоновых РТМ, происходящих в транскрипции, могло бы привести к выводу, что всеохватывающих руководящих принципов или идей здесь немного. Тем не менее, по-видимому, действительно есть некоторое число широких тем, которые повторяются, хотя специфика может меняться в зависимости от гистона, сайтов НРТМ и связывающихся белков. Действительно, регулирование хроматина может варьировать в разных промоторах и отдельных путях.

7.1. Гистоновый код

После этого затянувшегося обсуждения сложностей HPTMs возникает один ключевой вопрос: почему существует так много модификаций? Несомненно, что многие из них коррелируют с транскрипцией, а другие происходят во время различных матрицируемых ДНК процессов. Таким образом, одна гипотеза заключается в том, что существует гистоновый «код», сопрягающий специфические модификации с индивидуальными процессами (Strahl and Allis, 2000; Turner, 2000). Простейшим кодом могло бы быть бинарное отношение между HPTMs и активацией либо репрессией генов и отдельные HPTMs для других процессов. Данными в пользу такого кода является, как описано выше, наблюдаемая тенденция для одних HPTMs быть позитивно действующими, а для других — негативно действующими. Однако имеются наблюдения, которые не согласуются с простым бинарным кодом. Например, фосфорилирование H3S10 является как активирующим транскрипцию, что предположительно связано с раскрытием хроматина, так и участвующим в конденсации хромосом, делая хроматин еще более недоступным (Nowak and Corces, 2004). Аналогично этому недавно было показано, что уровень H3K9me возрастает во время индукции генов (Vakoc et al., 2005) в дополнение к его хорошо охарактеризованной роли в гетерохроматиновом сайленсинге. Наконец, многие из одних и тех же HPTMs возникают как в транскрипции, так и в репарации ДНК, которые в механистическом плане являются разными процессами.

На основе некоторых из этих соображений была предложена более общая гипотеза, где HPTMs служат в качестве ядерного ассоциированного с ДНК пути проведения сигнала, подобного цитоплазматическому проведению сигнала, которое генерируется и воспроизводится в основном через фосфорилирование Ser/Thr (Schreiber and Bernstein, 2002). В этой модели имеет место не строгий гистоновый код, а скорее узнавание и связывание НРТМ благодаря изобилию связывающих белок мотивов. Эта модель объясняет, каким образом любой сайт мог бы быть и активирующим, и репрессирующим и участвовать в более чем одном процессе, потому что различные связывающиеся эффекторные белки имеют сродство к одной и той же НРТМ для разных процессов.

7.2. Паттерны модификаций

Некоторые экспериментальные данные указывают на структурное изменение хроматина определенными HPTMs (модель 1). Это может быть результатом изменения заряда одного гистонового остатка или кластера таких остатков. Это особенно верно в тех случаях, когда остатки ацетилированы или фосфорилированы, что уменьшает положительный заряд участков гистона (см. раздел 5 главы 3). Такие c/s-изменения могут менять межнуклеосомные интервалы и снижать сродство гистонов к отрицательно заряженной ДНК, примером чего являются отрицательно заряженные пэтчи, встречающиеся на линкерном гистоне (Dou and Gorovsky, 2002). Эти типы HPTMs могут быт кумулятивными по своему влиянию, например, на транскрипционную активацию или для создания хроматиновых структур более высокого порядка, а не для производства двоичного эффекта «включено/ выключено» (Kurdistani et al., 2004; Henikoff, 2005).

Еще одна модель для «конечного результата» [«output»] мириад HPTMs сводится к тому, что код является сложным и считывается паттернами, а нередко и в форме временных последовательностей. Согласно этим взглядам, сложность паттернов в трехмерном пространстве и на протяжении какого-либо процесса, требующего многих связанных с хроматином этапов, таких, например, как транскрипция, дает осмысленный механистический результат. Были идентифицированы два типа паттернов НРТМ. Во-первых, имеются паттерны на одном и том же гистоновом «хвосте», или в «cis»-конфигурации, и, во-вторых, паттерны на разных гистоновых «хвостах», или в «trans»-конфигурации. Лучше всего охарактеризованный cis-паттерн находится между H3S10ph и H3K14ас на аминотерминальном «хвосте» (Cheung et al., 2000; Lo et al., 2000), где H3S10ph ведет к H3K14ac. Механизм, лежащий в основе установления этого паттерна, выяснен в структурных деталях: ацетилируюший фермент связывается с предварительно фосфорилированным «хвостом» H3, проявляя повышенное сродство благодаря большему числу контактных точек аминокислотной боковой цепи (Clements et al., 2003). Другими c/s-паттернам и являются ацетилирование H3K23 и метилирование H3R17 (Daujat et al., 2002) и метилирование H3R3 и ацетилирование H4K8 (Wang et al., 2001).

Как описано выше, был идентифицирован один trans-«хвостовой» паттерн, где первоначальное убиквитилирование H2BK123 ведет к метилированию H3K4 (Bnggs et al., 2002; Dover et al., 2002; Sun and Allis, 2002). Механизм, связывающий эти HPTMs, не выяснен, хотя существуют несколько возможных гипотез. Поскольку это связь от одной большой модификации (убиквитин) к несоседней НТРМ, одна из моделей предполагает, что убиквитин, как перемычка, закрепляет хроматин в открытом состоянии [ubiquitin wedges the chromatin open, like a crowbar] и делает возможным доступ метилирующего энзима к его сайту. Вторая общая модель сводится к тому, что H2BK123ub1 функционирует таким образом, что рекрутирует эффекторные белки, аналогично роли других HPTMs. Некаталитическая часть протеасомы требует для ассоциации хроматина убиквитилирования Н2В (Ezhkova and Tansey, 2004), и функционирование элонгационного комплекса FACT стимулируется убиквитилированием Н2В (Pavriet al., 2006), хотя еще не было показано, чтобы какой-либо комплекс непосредственно связывался бы с убиквитилированием Н2В.

7.3. Изменения в структуре хроматина, связанные с активацией транскрипции и элонгацией

Транскрипционно активные эухроматиновые районы содержат нуклеосомы, но в «развернутом» состоянии, обозначаемом как «бусинки на нити», или 11-нанометровая фибрилла. Нуклеосомы в этом состоянии все еще оказывают присущее им подавляющее влияние на транскрипционную машину. Некоторые транскрипционные факторы, будь то активаторы или репрессоры, могут получать доступ к своим сайтам, когда они содержатся в нуклеосомах, но другие этого не могут. Более того, аппарат, рекрутируемый связанными с ДНК регуляторами и ответственный за доставку RNA pol II к промоторам, ограничен присутствием нуклеосом. Ряд различных механизмов служит для реконфигурирования хроматина, приведения генов в готовность для последующей транскрипции или стимулирования инициации или элонгации. Некоторые из этих механизмов изображены на рис. 10.8.

Проблема с нуклеосомами во время транскрипции отчасти решается рекрутированием белковых комплексов для мобилизации и (или) изменения структуры нуклеосом. Эти комплексы делятся на два разных семейства: одно представлено SNF2H (или ISW1 и ISW2 у дрожжей), а другое — семейством Brahma-Swi/Snf (Narlikar et al., 2002; Peterson, 2002; Flaus and Owen-Hughes, 2004) Первое семейство мобилизует нуклеосомы, тогла как Swi/Snf также временно изменяет структуру нуклеосом. Ацетилированные нуклеосомы распознаются комплексом Swi/Snf через взаимодействие с бромодоменом (модель 1 на рис. 10.8).

Вторым механизмом, участвующим в активации генов, является избирательная утеря октамеров в промоторах. Например, у S. cerevisiae октамеры гистонов вытесняются в промоторе гена РН05 во время индукции транскрипции (модель 2 на рис. 10.8) (Boeger et al., 2003; Reinke and Horz, 2003) Кроме того, промоторы S. cerevisiae обладают конститутивно низкой плотностью нуклеосом, что делает возможным доступ для транскрипционных факторов (Sekinger et al., 2005). Все еще неизвестно, способствуют ли комплексы АТФ-зависимош ремоделинга генерированию и поддержанию этого редкого размещения, и если способствуют, то как они это делают.

Третий главный механизм, участвующий в установлении транскрипционных состояний, — это наличие вариантов гистонов. Имеются два типа вариантов гистонов, ассоциирующихся с активностью генов. Во-первых, вариант Н2А, называемый H2AZ, обнаруживается в нуклеосомах вокруг вокруг свободного от нуклеосом участка промотора [the promoter gap] и подготавливает ген к активации (Santisteban et al., 2000; Raisner et al., 2005; Zhang et al., 2005); специфичный комплекс АТФ-зависимого ремоделинга, называемый Swrl, замещает Н2А вариантом H2AZ (модель 3 на рис. 10.8) (Mizuguchi et al., 2004; дополнительные детали см. в главе 13). Во-вторых, одна из изоформ H3, называемая Н3.1, во время репликации инкорпорируется в хроматин, тогда как изоформа H3.З инкорпорируется не зависящим от репликации образом (Ahmad and Henikoff, 2002), с помощью шаперона HIRA (histone regulator А). Этот вариант преимущественно обнаруживается внутри ORFs генов (Mito et al., 2005), заставляя полагать, что его размещение является процессом, сочетанным с транскрипцией.

Для преодоления нуклеосомного барьера для элонгации RNA pol II (и RNA pol I) существуют дополнительные механизмы. Было изолировано большое число факторов, влияющих на транскрипционную элонгацию (Sims et al., 2004). Обнаружили, что один из этих факторов позволяет RNA pol II преодолевать нуклеосомы. Этот фактор известен как FACT (аббревиатура от Facilitate Chromatin Transcription). Важно, что FACT функционирует исключительно через посредство нуклеосом, связывается с ними и затем стимулирует смещение одного димера Н2А/Н2В (модель 4 на рис. 10.8) (Belotserkovskaya et al., 2003). Коль скоро транскрипция прекращается, FACT также стимулирует реконституцию нуклеосомы. Интересно, что FACT осуществляет свои функции в отсутствие энергии, но физически взаимодействует с CHD1, белком, который гидролизует АТФ для мобилизации нуклеосом и связывания с активной меткой H3K4те. Более того, FACT также взаимодействует с NuA4 — комплексом, содержащим активность HAT. Хотя FACT может способствовать смещению димера Н2А/Н2В in vitro независимым от АТФ образом, возможно, что это стимулируется его взаимодействием с такими факторами, как CHD1, которые мобилизуют или изменяют структуру нуклеосом in vivo, а также взаимодействие с HPTMs (Reinberg and Sims, 2006).