Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Дополнительные экспериментальные подходы продолжали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транскрипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь «открытую» конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов исследователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — мощный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как формальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, чтобы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувствительны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной (Hebbes et al., 1994). У S. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно «молчащих» районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования гистонов (Braunstein et al., 1993). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.

Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядерных гистонов не были идентифицированы вплоть до середины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфераза гистонов (HAT) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena, который характеризуется высокими скоростями транскрипции (Brownell et al., 1996). Ключевым подходом для выявления активности HAT оказался анализ «в геле» («in-gel»): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активностью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима А, на локализованные гистоны. Это делало возможным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у S. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5, о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипционными активаторами. Одновременно первая деацетилаза гистонов (HDAC) была выделена посредством биохимической очистки (Taunton et al., 1996). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помощью ингибитора, связанного с нерастворимым матриксом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрессии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболизируют ацетильные группы на гистонах, привели к модели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs: связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацетилировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют YDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклеосомы и, соответственно, к ап- или даун-регуляции гена (рис. 10.2).

Было показано, что многие другие хорошо известные коактиваторы и корепрессоры обладают активностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами (Sterner and Berger, 2000; Roth et al., 2001). Более того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и репрессии генов. Эти энзимы часто являются компонентами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментативная активность — это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с ТАТА белка (TBR TATA-binding protein) (Grant et al., 1998). Интересно, что некоторые ядерные рецепторы гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связаны с гормонами-лигандами), и как активаторы транскрипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, рекрутируя HDACs, когда они не связаны с лигандами, и HATs, когда связаны (Baek and Rosenfeld, 2004).

^{Рис. 10.2. Энзимы, модифицирующие гистоны, рекрутируются к промоторам связывающимися с ДНК транскрипционными факторами}

^{Ацетилтрансферазы гистонов (HAT) рекрутируются активаторами, которые связываются с активирующими нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирование локальных гистонов, которые, как известно, вносят вклад в активацию транскрипции. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связываются с репрессивными нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (URS) и деацетилируют локальные гистоны Это вносит вклад в репрессию транскрипции}

Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырех коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении предпочтительного субстрата (рис. 10.3; табл. 10.1), хотя каждый энзим редко «нацелен» только на один сайт. Одно главное семейство HAT — GNAT (сокращение для Gcn5 related acetyltransferase) «нацелено» на гистон H3 как на свой основной субстрат. Второе главное семейство, семейство MYST, в качестве своего основного субстрата«нацелено» на гистон Н4. Третье главное семейство — СВР/р300 — «нацелено» и на H3, и на Н4 и является самым неразборчивым. Был выполнен структурный анализ для каталитических доменов первых двух главных семейств (GNAT и MYST), и они оказались различающимися; структура семейства СВР/р300 пока еще не раскрыта. Между прочим, каждое из этих семейств ацетилтрансфераз способно также ацетилировать негистоновые субстраты (Glozak et al., 2005).

Как обсуждалось выше, существуют три модели, описывающие роль HPTMs в регулирование структуры хроматина (рис. 10.1). Первая модель рассматривает структурные изменения в хроматине, индуцируемые прямыми влияниями HPTMs, такие как изменения заряда. В этом случае нейтрализация ацетилированием положительно заряженного лизина уменьшает силу связывания сильно основных гистонов или гистоновых «хвостов» с отрицательно заряженной ДНК и таким образом открывает сайты связывания с ДНК (Vettese-Dadey et al., 1996). Имеются также данные, все еще в пользу первой модели, что ацетилирование может декомпактизировать нуклеосомные порядки, что согласуется с ролью в открывании хроматина для активации генов (Shorgen-Knaak et al., 2006). Третья модель предполагает, что HPTMs обеспечивают поверхность связывания, чтобы белки ассоциировались с хроматином и регулировали ДНК-матричные процессы; впервые это было показано для ацетилирования. Специализированный белковый домен, названный бромодоменом и обычно обнаруживаемый в ассоциированных с хроматином белках, специфически связывается с ацетилированными лизинами (рис. 10.3) (Dhalluinet al., 1999). Бромодомены присутствуют во многих HATs, таких как Gcn5 и СВР/рЗОО. Белки с этим мотивом, когда они являются частью крупных комплексов, ассоциированных с хроматином или изменяющих его, — например, таких как зависимый от АТФ ремоделирующий комплекс, Swi/ Snf — стимулируют его связывание с хроматином (Hassan et al., 2002). Другими примерами белков, которые содержат бромодомены, обладающие специфичностью связывания с ацетилированными гистонами, являются Tafl и Bdfl в комплексе TFIID, Rsc4 в ремоделирующем комплексе Rsc и Brd2 в большом семействе бромодоменных белков.

Рис. 10.3. Охарактеризованные сайты ацетилирования гистонов

^{Гистоны ацетилируются главным образом по лизиновым остаткам, локализованным в аминоконцах H3 и Н4, за исключением H3K56, локализованного в глобулярном домене. Показаны белки, проявляющие специфичность связывания с ацетилированными гистонами}

Существуют многочисленные ферменты HDAC, удаляющие ацетильные группы (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Они распадаются на три каталитические группы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, которые обозначаются как энзимы типа I, типа II и типа III, или родственные Sir2. Ферменты типа I и типа II обладают близким механизмом деацетилирования, который не связан с кофактором, тогда как ферменты, родственные Sir2, требуют кофактор NAD в качестве компонента их каталитического механизма. Структура представителей всех этих трех семейств выяснена. Многие HDACs обнаруживаются в крупных мультисубъединичных комплексах, компоненты которых служат для «нацеливания» этих энзимов на гены, что ведет к репрессии транскрипции. Например, Rpd3 является частью крупного комплекса, включающего HDAC Sin3, которая взаимодействует с репрессорами, связанными с ДНК (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Rpd3 является также частью малого комплекса, «нацеленного» на открытые «рамки считывания» генов (ORFs) через ассоциацию хромодомена с H3KЗбше (дальнейшее обсуждение хромодоменов см. в разделе 4). Результатом этого оказывается деацетилирование гистонов, частично подавляющее инициацию внутренней РНК-полимеразы II (pol II), а также регулирующее различные этапы цикла транскрипции (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005).

3. Фосфорилирование

Фосфорилирование — лучше всего известная РТМ, поскольку уже давно поняли, что киназы регулируют проведение сигнала с клеточной поверхности через цитоплазму и в ядро, приводя к изменениям в экспрессии генов. Гистоны были одними из первых белков, фосфорилирование которых было обнаружено. К 1991 году открыли, что когда клетки стимулировали к пролиферации, происходила индукция так называемых «немедленных-ранних» [«immediate-early»] генов, и они становились транскрипционно активными и функционировали, стимулируя клеточный цикл. Эта повышенная экспрессия генов коррелирует с фосфорилированием гистона H3 (Mahadevan et al., 1991). Остаток серина 10 гистона H3 (H3S10) оказался важным сайтом фосфорилирования для транскрипции от дрожжей до человека и, по-видимому, особенно важен у Drosophila (Nowak and Corces, 2004). Были идентифицированы многие киназы, имеющие «мишенью» этот сайт, в том числе Msk1/2 и родственная ей Rsk2 у млекопитающих и SNF1 у S. cerevisiae (Sassone-Corsietal., 1999; Loetal., 2001; Soloagaetal., 2003). Исследования линкерного гистона Н1 у Tetrahymena показали, что фосфорилирование этого гистона также может влиять на контроль транскрипции.

Возможно, наперекор интуиции фосфорилирование некоторых остатков коррелирует с конденсацией хромосом в митозе и мейозе. Неясно, каким образом фосфорилирование участвует в этом процессе, но недавно было показано, что фосфорилирование H3S10 действует как временной [temporal] переключатель, извлекающий НР1, связанный с метилированным по соседству остатком H3K9, и называемый «бинарным переключателем methyl-phos» (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). Остается посмотреть, может ли это, возможно совместно с фосфорилированием H3S28 и H3Т11, влиять на конденсацию хроматина посредством рекрутирования конденсинового комплекса и митотического веретена (Nowak and Corces, 2004).

Меньше известно о точной роли фосфорилирования гистонов в механистических терминах. Имеются данные в пользу всех трех моделей, касающихся роли HPTMs. Во-первых, фосфорилирование гистонов изменяет степень компактности хроматина in vivo (модель 1) Действительно, работы на Tetrahymena показали, что коллективный «пэтч отрицательных зарядов», образующийся в результате фосфорилирования кластеров, находящихся по соседству с остатками в линкерном гистоне Н1, влияет на сродство его связывания с ДНК. явно увеличивая транскрипционный потенциал локального хроматинового окружения (Dou and Gorovsky, 2002). В поддержку модели 2 говорят данные о том, что белки, связанные с хроматином, могут быть смещены фосфорилированием. Недавно это было продемонстрировано пониженной афинностью связывания НР1 во время митоза после митоз-специфичного фосфорилирования H3S10 (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). В поддержку Модели 3 свидетельствуют данные о том, что адапторный белок 14-3-3 (известный белок, связывающий фосфатную группу) распознает H3S10ph в промоторах индуцибельных генов (Macdonald et al., 2005).

4. Метилирование

Метилирование как ковалентная модификация гистонов является более сложной, чем любая другая, поскольку оно может происходить как по лизинам, так и по аргининам. Кроме того, в отличие от любой другой модификации в группе 1, последствия метилирования могут быть как позитивными, так и негативными по отношению к транскрипционной экспрессии в зависимости от положения остатка в гистоне (табл. 10.1). Еще один уровень сложности связан с тем фактом, что по каждому остатку могут быть множественные метилированные состояния. Лизины могут быть моно- (me1), ди- (me2) или три- (me3) метилированными, тогда как аргинины могут быть моно- (me1) или ди- (me2) метилированными. Поскольку на H3, Н4, Н2А и Н2В имеются по меньшей мере 24 идентифицированных сайта метилирования лизинов и аргининов, число различающихся метилированных состояний нуклеосом невообразимо велико. Такой комбинаторный потенциал метилированных нуклеосом может быть необходим, по крайней мере отчасти, чтобы сделать возможным регулирование таких сложных и динамических процессов, как транскрипция, которая требует последовательных и точно размещенных во времени событий (Jenuwein and Allis, 2001; Y. Zhang and Reinberg, 2001; Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005; Wysocka et al., 2006a).

4.1. Метилирование лизинов

Тот факт, что лизиновые остатки в гистонах метилированы, был известен многие десятилетия. Однако биологическое значение этой модификации стало высвечиваться лишь недавно, после идентификации первой метилтрансферазы лизинов, использующей гистоны в качестве своего субстрата (Rea et al., 2000). В настоящее время идентифицировано большее количество лизиновых метилтрансфераз (HKMTs), и определены сайты, модифицируемые ими на гистонах (Martin and Zhang, 2005). Все эти ферменты, за исключением Dot 1, имеют общий домен SET, который содержит каталитически активный сайт и делает возможным связывание с S-аденозил-L-метиониновым кофактором.

Из большого числа известных метилированных сайтов к сегодняшнему дню хорошо охарактеризованы шесть; пять на H3 (К4, К9, К27, К36, К79) и один на Н4 (К20). Метилирование по H3K4, H3K36 и H3K79 в целом было связано с активацией транскрипции, а остальные варианты — с репрессией (табл. 10.1). Кроме того, два из этих сайтов — H3K79me и H4K20me — участвуют, как считается, в процессе репарации ДНК. Были идентифицированы специфические белки-связки, распознающие каждый из шести охарактеризованных сайтов метилирования (рис. 10.4). Эти белки имеют домен узнавания лизина, относящийся к одному из трех разных типов: хромо, тюдор и PHD-повтор. Ниже каждая из этих охарактеризованных модификаций обсуждается более детально.

Метилирование H3K4 связано с эухроматином, а именно с генами, которые активны или должны стать активными. Демонстрация того, что метилирование H3K4 коррелирует с активным хроматином, была получена при анализе локуса куриного β-глобина и локусов типа спаривания почкующихся дрожжей (Litt et al., 2001; Noma et al., 2001). ChlPs с использованием антител, специфичных к метилированным H3K4, показали, что островки модифицированных гистонов метят активные гены. Последующая работа на дрожжах показала, что в процессе активной транскрипции появляется триметильное состояние (H3K4me3) (Santos-Rosa etal., 2002).

У дрожжей во время активации транскрипции модификация H3K4me3 наблюдается на 5’-концах генов.

Рис. 10.4. Сайты метилирования гистонов, их белковые связки и функциональная роль в геномных процессах

^{Метилирование гистонов происходит по лизиновым остаткам в гистонах НЗ и Н4. Некоторые метилированные остатки лизина ассоциированы с активацией транскрипции (зеленый флажок Me), тогда как другие участвуют в репрессивных процессах (красный флажок Me). Показаны белки, связывающиеся с определенными метилированными остатками лизина}

Полагают, что за эту метку отвечают три компонента транскрипционной машины. Во-первых, RNA pol II, фосфорилированная по Ser-5 карбокситерминального домена (CTD), может рекрутировать Setl HKMT, которая метилирует H3K4 поблизости от промоторов (рис. 10.5). Такое фосфорилирование в норме высвобождает RNApol II из комлекса инициации транскрипции в комплекс ранней элонгации (часто называемый promoter clearance или escape). Второй компонент, рекрутирующий H3K4me3, это комплекс RAF, который регулирует различные этапы метаболизма РНК и также взаимодействует с Setl. Третьим компонентом, важным для установления H3K4me3, является моноубиквитилирование Н2В по Lys-123 (H2BK123ub1 или H2BK120ub1 у человека; обсуждается ниже, в разделе 6). Что остается неясным, так это вопрос о том, какие процессы транскрипционной элонгации контролирует H3K4me3 (Hampsey and Reiberg, 2003); однако факторы, специфически связывающиеся с метилированными H3K4me3, начинают выявлять его роль.

В механистическом плане метилирование H3K4 может приводить к рекрутированию таких специфических факторов, как белок CHD1, который, как было показано, связывается с H3K4me2 и me3 (рис. 10.4), и комплекс NURF, который, как известно, мобилизует нуклеосомы в активных генах у Drosophila. Домены, опосредующие связь с метилированными H3K4, являются тандемным набором хромодоменов в Chdl (Sims et al., 2006) и «пальцем» PHD в NURF (Li et al., 2006). Среди других белков, рекрутируемых метилированием H3K4, — АТФ-аза ISWI, которая связывается непрямым образом, через посредство другого белка (белков). Напротив, имеются данные, что репрессорный комплекс NuRD у млекопитающих больше не связывается с метилированными «хвостами» H3K4 (D.Y. Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005).

Метилирование по H3K4, по-видимому, взаимодействует с другими модификациями. Например, метилирование H3K9 HKMT SUV39H in vitro предотвращается, если H3K4 метилирован и H3S10 фосфорилирован. Это вполне может быть способом закрытия репрессивной модификации H3K9 на активно транскрибируемых генах. При более сложной форме взаимодействия типа «trans-tail» моноубиквитинилирование H2BK123 влияет на уровни H3K4me3. Как это происходит — неясно, но одно из предположений заключается в том, что комплекс Setl не может триметилировать H3K4, если нуклеосома (нуклеосомы) не находится в определенном конформационном состоянии, которое определяется убиквитилированием Н2В (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005).

Белок Setl/MLL/ALLl/HRX, который является гомологом Setl у человека, может рекрутироваться к промоторам гена НОХ. Другая H3K4 HKMT, SMYD3, оказалась сцепленной с транскрипционной активацией. Метилирование с помощью SMYD3 также было связано с индукцией клеточной пролиферации. В самом деле, ограниченный анализ человеческих энзимов, метилирующих H3K4, позволяет предполагать их участие в генезе рака (D.Y. Lee et al., 2005).