Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Программа эпигенетических модификаций зависит от генетической детерминации закладки и развития половых клеток в ранних постимплантационных зародышах. Самые ранние предшественники половых клеток возникают из небольшой группы клеток в ранних постимплантационных эмбрионах в результате получения сигнальных молекул из другой части зародыша, экстра-эмбриональных линий, включая плаценту. Развитие половых клеток после их выделения регулируется генетически, определяя их эпигенетическую программу таким образом, что генные продукты, необходимые в соматических клетках, в половых клетках репрессированы. С другой стороны, половые клетки нуждаются в специальных генетически управляемых функциях, например, таких как эпигенетическое репрограммирование, установление импринтинга, хромосомная рекомбинация во время мейоза и редукционные деления для формирования гаплоидных гамет.

До начала развития половых клеток в эмбрионе происходит установление наиболее ранних линий. Плюрипотентные клетки эпибласта ранних постимплантационных эмбрионов являются источником всех соматических клеток, а также примордиальных половых клеток. Дифференцировка соматических тканей в три первичные клеточные линии (эктодерма, мезодерма и эндодерма) начинается в ответ на сигналы экстра-эмбриональных тканей. В это же время примордиальные половые клетки также возникают из специального набора клеток, локализованных в проксимальной части эпибласта. Трофэктодерма (ТЕ) бластоцисты возникает раньше и является первым событием выделения линии в эмбрионах млекопитающих, которая в будущем дает плаценту (рис. 20.2). Из ICM развивается весь взрослый организм; плюрипотентные стволовые клетки (ES) происходят из клеток внутренней клеточной массы (ICM). Эта группа клеток возникает в развитии эмбриона на стадии морулы перед имплантацией, когда ICM клетки и слой трофэктодермы (ТЕ) разделены и формируют бластоцисту, которая затем имплантируется в матку. Эпигенетическая регуляция экстраэмбриональных (ТЕ) и эмбриональных (ICM) линий существенно различается. Например, общий уровень метилирования ДНК в экстраэмбриональных тканях ниже. Могут отличаться поддержание импринтинга и инактивация импринтной X хромосомы с импринтингом. ICM и ТЕ-клетки, так же как примордиальные половые клетки (PGC) детерминируются генетической программой, включая транскрипционные факторы и плюрипотентные гены.

Рис. 20.2. Цикл эпигенетического репрограммирования в развитии млекопитающих

^{Сразу после оплодотворения упаковка отцовского пронуклеуса (PN) в зиготе происходит без Н3K9me2 и Н3K27me3, в то время как материнский хроматин содержит эти метки. Отцовский PN быстро теряет также 5-метилцитозин (5МеС) в разных участках гена, в то время как в материнском геноме этого не происходит. Пассивная утрата 5МеС происходит во время преимплантационного развития до стадии бластоцисты, когда клетки внутренней массы (ICM) начинают приобретать высокий уровень Н3K9me2 и Н3K27me3. Плацента, которая происходит в основном из трофэктодермы (ТЕ) бластоцисты, остается относительно гипометилированной. Примордиальные половые клетки (PGC) подвергаются деметилированию 5МеС и Н3K9me2 перед и после вхождения в гонады. De novo ДНК метилирование, включая родитель-специфический импринтинг, происходит на более поздних стадиях развития половых клеток}

Как эти различные генетические программы впервые возникают в ранних эмбрионах и какой вклад вносят в установление этих программ межклеточные взаимодействия, эпигенетические модификации или цитоплазматические факторы яйцеклеток, пока неясно.

В дополнение к эпигенетической информации, которая переносится генами при импринтинге из гамет в эмбрион, в момент оплодотворения происходят другие важные эпигенетические события. В оплодотворенной зиготе геном спермия быстро теряет метилирование ДНК, а затем приобретает модификации ДНК и гистонов при последующих клеточных делениях (рис. 20.2). Материнский геном устойчив к зиготическому ДНК деметилированию и подвергается более растянутому деметилированию во время дробления ранних эмбрионов. Хотя эти в какой-то степени противоположные и разные эпигенетические программы приводят к общей потере эпигенетической информации в гаметах, вероятно, такое динамическое репрограммирование событий взаимодействует с клеточными и генетическими процессами, которые определяют ранние процессы клеточного разделения в ICM и ТЕ линиях, соответственно. Таким образом, эпигенетический жизненный цикл никогда не заканчивается и никогда не начинается, а постоянно взаимодействует с генетической программой, которая определяет развитие ICM и ТЕ, плюрипотентных стволовых клеток, половых клеток и, возможно, других линий.

2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификацию половых клеток (от раннего эмбриона к половым клеткам)

2.1. Принципы развития половых клеток в различных группах животных

У животных спецификация половых клеток, сегрегация половых клеток от соматических клеток, является одним из наиболее ранних событий в развитии (Surani et al., 2004). Половые клетки приобретают тотипотентное состояние. Существует два основных способа закладки линии половых клеток, относящихся к преформации (этот термин от старого использования слова преформизм) и эпигенезу (Extravour and Akam, 2003). Первый включает наследование предсуществующих детерминант половых клеток специфическими клетками так, как это происходит у Caenorhabditis elegans и Drosophyla melanogaster (Leatherman and Jongens, 2003; Blackwell, 2004). В противоположность этому эпигенетический способ спецификации половых клеток является процессом, в котором потенциально эквивалентная группа плюрипотентных клеток приобретает способность стать половыми клетками в ответ на индуктивные сигналы, в то время как оставшиеся клетки становятся в будущем соматическими клетками (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Такой механизм спецификации половых клеток действует у мышей и, возможно, у других млекопитающих, включая человека.

2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих

Примордиальные половые клетки у мышей впервые обнаруживаются на стадии Е7.5 (на стадии раннего зачатка, ЕВ) как скопление примерно 40 клеток, которые являются основателями популяции линии половых клеток (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Эти клетки позитивны по щелочной фосфатазе и локализуются в пределах экстраэмбриональной мезодермы у основания аллантоиса (рис. 20.4, правая панель). Клональный анализ показал, что проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5, стадии преполоски (PS) и первичной полоски (ES) дают начало PGC, а также тканям экстраэмбриональной мезодермы (Lawson and Hage, 1994). PGC формируются под влиянием сигнальных молекул, продуцируемым экстраэмбриональной эктодермой и первичной эндодермой (рис. 20.3). Втр4 и Втр8Ь являются сигнальными молекулами, которые регулируют компетентность и спецификацию половых клеток (Lawson etal., 1999).

Чтобы понять генетическую программу спецификации PGC, из единичных клеток PGC-основателей и окружающих их соматических клеток была получена кДНК (Saitou et al., 2002). Для того чтобы различить PGC и соматические клетки был использован ряд маркеров. При таком скрининге сначала был идентифицирован fragilis, новый белок семейства интерферониндуцируемых трансмембранных белков, и Stella, ядерно-цитоплазматический белок. Дальнейшие исследования показали, что fragilis экспрессируется в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 (рис. 20.3), когда они становятся компетентными для образования как PGC, так и окружающих их клеток экстраэмбриональной мезодермы Fragilis-позитивные клетки во время гаструляции перемещаются в задний проксимальный район. Впоследствии среди этой популяции клеток обнаруживается популяция основателей PGC, экспрессирующих stella. Одновременно в основателях PGC обнаруживается экспрессия плюрипотентных генов, включая Sox2 и Oct4, что дает основание полагать, что PGC проявляют плюрипотентность, которая утрачивается соседними соматическими клетками. Напротив, в основателях PGC ряд генов репрессированы, включая Нахb1 и Haxa1, экспрессия которых в этот период значительно повышается в соседних соматических клетках. Репрессия Нах генов является частью механизма, который лежит в основе репрессии соматической судьбы основателей PGC (Saitou et al., 2002).

Рис. 20.3. Ранняя детерминация половых клеток у мыши

^{Плюрипотентные проксимальные клетки эпибласта (синий), которые происходят из ICM (см. рис. 20.1 и 20.2) получают экстраклеточный сигнал В MP4 и становятся компетентными к развитию половых клеток (розовый). Активация Blimp1 коммутирует эти клетки к развитию в линию примордиальных половых клеток (красный), в то время как остальные клетки становятся соматическими}

Основываясь на анализе выхода основателей ППК, очевидно, что так же как и у других организмов, репрессия соматической программы является основной особенностью специализации PGC у мышей (Seydoux and Strome, 1999; Blackwell, 2004; Surani et al., 2004). Для определения кандидатов генной репрессии были проанализированы гистон лизин метилтрансферазы (НКМТ) с целью выяснить, существуют ли различия в их экспрессии в PGC и соседних соматических клетках. Экспрессия некоторых их этих генов, G9a, Pfm1, Set1 и EZh2 была выявлена как в PGC-основателях, так и в соматических клетках. Однако один ген, Blimp 1(В-lymphocyte maturation-induced protein 1), кодирующий белок, индуцирующий созревание лимфоцитов, экспрессировался только в основателях PGC, но не в соседних соматических клетках на стадии Е7 (Obinata et al., 2005). Blimp1 является репрессором транскрипции, содержит SET/PR домен, пролин-богатый район, который может рекрутировать Groucho и HDAC26, пять С2Н2 цинковых пальца, формирующих комплекс с G9a и кислым концом (Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Gyori et al., 2004; Sciammas and Davis, 2004). Blimp1 впервые был идентифицирован, благодаря его роли при специализации плазматических клеток после репрессии В-клеточной программы в клетках-предшественниках (Turner et al., 1994). Blimp1 активно экспрессируется во время развития мыши (Chang et al., 2002).

Детальный анализ Blimp 1 в ранних эмбрионах мыши привел к неожиданным открытиям. Было установлено, что Blimp 1 начинает экспрессироваться в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 в начале гаструляции, сначала только в 4–6 клетках, которые находятся в непосредственном контакте с клетками экстраэмбриональной эктодермы (рис. 20.3) (Obinata et al., 2005). Экспрессия Blimp 1 обнаруживается на одном конце короткой оси в участке, в котором будет сформирован задний проксимальный район. Число прогрессивно увеличивается, так что на стадии средней полоски их число достигает примерно 20; они формируют плотное скопление в заднем проксимальном районе на стадии Е6.75. На стадии Е7.5, раннего зачатка (ES), число Blimp 1-позитивных клеток увеличивается примерно до 40 (рис. 20.4). Эти клетки являются основателями PGC, экспрессируют классический PGC-маркер, щелочную фосфатазу, и в них начинается синтез stella (рис. 20.3). Эксперименты по генетическому прослеживанию линии подтвердили, что все Blimp 1-позитивные клетки, происходящие из эпибласта на стадии Е6.25 и далее, действительно являются клетками-предшественниками линии PGC. Эти данные находятся в противоречии с ранее существовавшей гипотезой, основанной на клональном анализе, согласно которой проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5 не являются линиями ограниченными, дающими только PGC, поскольку клональные потомки индивидуальных клеток могут давать начало как соматическим, так и половым клеткам (Lawson and Hage, 1994; McLaren and Lawson, 2005). Это противоречие, вероятно, объясняется тем, что при клональном анализе маркированные клетки исходно могут быть Blimp 1-негативными, но при последующих делениях возникают позитивные клетки, которые дают PGC-клетки, в то время как дочерняя клетка дает соматических потомков. Механизм, который регулирует увеличение Blimp 1-позитивных клеток, пока неизвестен.

Рис. 20.4. Развитие половых клеток у разных видов животных

^{У С. elegans специализация линии половых клеток (красный) начинается после первого деления зиготы с экспрессией Pie 1, которая приводит к транскрипционному покою Другая клетка (синий) дает начало соматическим клеткам. У D. melanogaster предшественниками половых клеток являются так называемые полюсные клетки, находящиеся на одной стороне зиготного синцития (многоядерного); транскрипционный покой в этих клетках зависит от локализации РНК гена Pgc У Mus musculus самые ранние предшественники половых клеток видны по экспрессии Blimp1 в основании аллантоиса. Blimp1 инициирует транскрипционный покой в этих клетках}

2.3. Роль Blimp 1 в спецификации PGC

Дальнейший анализ роли Blimp 1 в спецификации PGC помог пониманию механизмов, лежащих в основе спецификации половых клеток у мышей. Утрата функции Blimp 1 показала, что она является решающим фактором PGC спецификации у мышей (Ohinata et al., 2005; Vincent et al., 2005). У Blimp 1 мутантов эмбрионы на стадии Е7.5 содержат аберрантный кластер почти PGC-подобных клеток, в то время как в контрольных эмбрионах PGC продолжают пролиферировать и начинают мигрировать из кластера. Более того, число аберрантных PGC-подобных клеток на стадии Е8.5 не увеличивается (Obinata et al., 2005).

Одноклеточный анализ мутантных PGC-клеток показал отсутствие репрессии Нох генов. Следовательно, Blimp 1, вероятно, играет роль в репрессии соматической программы в основателях PGC. У мутантов наблюдалось также нарушение в регуляции активации PGC специфических генов, таких как stella и Nanos3, а также некоторых плюрипотентных генов, таких как Sox2. Эти данные свидетельствуют, что Blimp 1 играет важную роль как транскрипционный регулятор в процессе спецификации PGC и препятствует приобретению соматической программы в этих клетках.

Исследования на В-клетках показали, что Blimp 1 индуцирует их дифференцировку в плазматические клетки, репрессируя основные молекулы, необходимые для их поддержания (Turner et al., 1994; Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Sciammas and davis, 2004; более детально, см. гл. 21). Это происходит через образование Grouch и HDAC2 репрессорного комплекса (Ren et al., 1999). По-видимому, их «цинковые пальцы» также важны для образования комплекса с G9a (Gyory et al., 2004), являющейся НКМТ, которая необходима для H3K9me2. Однако функционирует ли Blimp 1 в процессе спецификации PGC через образование нового комплекса, по-прежнему неясно, поскольку нет данных о НКМТ активности домена Blimp 1SET/PR.

Blimp 1 является эволюционно консервативным геном как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных и обладает различными функциями. Например, он играет роль в развитии разных линий у позвоночных, таких как рыба-зебра и шпорцевая лягушка (de Souza et al., 199; Roy and Ng, 2004; Hernandez-Lagunas et al., 2005), хотя и не является высоко специфичным для развития половых клеток. Это означает, что этот ген приобрел новую функцию в спецификации PGC у мышей и, возможно, у всех млекопитающих. Это предполагает. что для этого крайне консервативного гена должны были эволюционировать дополнительные контролирующие элементы, чтобы регулировать его экспрессию в PGC-предшественниках и клетках-основателях.

2.4. Репрессия соматической программы в половых клетках — явление, эволюционно консервативное

Механизм спецификации половых клеток не является эволюционно консервативным, что становится очевидным при сравнении его у мышей и двух других хорошо исследованных видов, D. melanogaster и С. elegans (Seydoux and Strome, 1999). Различия в механизмах спецификации половых клеток сначала объясняли различиями в ранних этапах развития у разных организмов, а также дополнительными сложностями, возникающими в результате феномена геномного импринтинга у млекопитающих. Важно отметить, что репрессия программы экспрессии соматических генов во время спецификации половых клеток является общим феноменом для разных организмов, хотя их молекулярные механизмы могут различаться (Seydoux and Strome, 1999; Leatherman and Jongens, 2003; Saitou et al., 2003; Blackwell, 2004).

У С. elegans первое клеточное деление зиготы является ассиметричным. В результате него появляется соматическая клетка (АВ); вторая клетка (Р1) отделяется и дает начало линии половых клеток (рис. 20.4). Действительно, каждая из этих PI, Р2 и РЗ клеток при делении дает соматические клетки; последние начинают транскрипцию и дифференцировку. Клетки Р1—РЗ, которые дадут линию половых клеток, остаются транскрипционно неактивными. Транскрипционная активность подавляется цинк-пальцевым белком PIE-1, который ингибирует элонгацию транскрипции за счет конкуренции за фосфорилирование Ser-2 карбокситерминального домена (CTD) РНК-полимеразы И (pol II) (Van Doren et al., 1998; Seydoux and Strome, 1999: Zhang et al., 2003; детали см. гл. 10). Однако и соматические, и половые бластомеры имеют транскрипционно пермиссивное состояние хроматина, что было показано высоким уровнем H3K4те в геноме. Позднее, когда бластомер Р4 делится и образует две клетки половой линии, Z2 и Z3, репрессивное состояние хроматина становится выраженным, утрачивается H3K4те и выявляется высокий уровень репрессивного H3K9me (Schaner et al., 2003). Таким образом, в процессе становления линии половых клеток у С. elegans хроматин из транскрипционно пермиссивного состояния меняется в неактивное состояние.

Становление линии половых клеток у D. melanogaster отличается от того, что наблюдается у мышей и червя. Предшественники линии половых клеток, которые называются полюсными клетками, выявляются до начала эмбрионального развития в оплодотворенном многоядерном яйце (рис. 20.4). Они тоже являются транскрипционно неактивными из-за отсутствия фосфорилирования pol II CTD, так же как это наблюдается у С. elegans (Seydoux and Dunn, 1997; Van Doren et al., 1998; Schaner et al., 2003). Хотя транскрипционный сайленсинг связан также и с репрессивной модификацией хроматина с помощью H3K9те, полярные клетки будут формировать только половые клетки. Таким образом, эти клетки подобны Z2 и Z3 клеткам С. elegans, которые предназначены только для образования линии половых клеток. Кроме того, транскрипционный сайленсинг в полярных клетках, по-видимому, регулируется геном полярного гранулярного компонента pgc (polar granule component), поскольку потеря pgc приводит к утрате репрессии, хотя полярные клетки по-прежнему обнаруживаются. В мутантных полярных клетках происходит фосфорилирование pol II CTD по Ser-2 (Deshpande et al., 2004; Martinho et al., 2004). Предполагается, что pgc может блокировать ключевой компонент, необходимый для фосфорилирования pol II CTD, ингибируя таким образом переход от комплекса преинициации к комплексу элонгации.