Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Анализ cпецификации половых клеток во время развития у мышей, мух и червей четко показывает, что репрессия транскрипции, которая, по-видимому, необходима для подавления программы соматических клеток, выявлена во всех трех организмах, хотя механизмы, с помощью которых это достигается, существенно различаются. Это, очевидно, объясняется различиями в ранних этапах развития разных видов.

2.5. Регуляция эпигенетической программы у мышей после спецификации PGC

Активное эпигенетическое программирование и репрограммирование в линии половых клеток продолжается после спецификации PGC (Seki et al., 2005). Этот период развития отмечен стиранием некоторых репрессивных эпигенетических модификаций, что позволяет клеткам половой линии приобрести плюрипотентные характеристики, которые, возможно, являются предпосылкой последующей тотипотентности.

Основными наблюдаемыми изменениями являются исчезновение H3K9me2 на стадии Е8.0 и уменьшение уровня HP 1а на стадии Е 9.0 в эухроматиновых и перицентрических гетерохроматиновых районах (Seki et al., 2005). Вместе с тем в PGC, начиная со стадии Е8.0 и далее, происходит уменьшение общего уровня метилирования ДНК. В то время как происходит уменьшение H3K9me2 и ДНК метилирования, наблюдается прогрессивное увеличение H3K27me3, репрессивной модификации, опосредованной Ezh-белком группы polycomb в, Ezh (рис. 20.5). Потеря ДНК метилирования сопровождается репрессией de novo ДНК-метилтрансфераз Dnmt За и Dnmt3b, а также временным уменьшением Dnmtl. Следует заметить, что потеря ДНК метилирования H3K9me2 также совпадает с возобновлением экспрессии гена Nanog, который является ключевым геном, связанным с плюрипотентностью (Yamaguchi et al., 2005). Nanog впервые экспрессируется во внутренних клетках на стадии поздней морулы и в клетках внутренней массы бластописты. Однако экспрессия этого гена быстро уменьшается после имплантации и возобновляется только после спецификации PGC. Вместе с экспрессией других плюрипотентных генов, включая Oct4, Sox2 и Esgl, это показывает, что половые клетки приобретают плюрипотентные свойства (рис. 20.5).

Дополнительные события интенсивного эпигенетического программирования происходят после попадания PGC в развивающиеся гонады (Surani et al., 2004). Во-первых, происходит увеличение метилирования H3K4 и ацетилирования H3K9, что является характерным для пермиссивного состояния хроматина, исключающего H3K9те. Кроме того, происходит повсеместное геномное деметилирование ДНК (рис. 20.5), включающее стирание родительских импринтов и метилирования в единичных копиях генов В женских эмбрионах в это время происходит реактивация неактивной Х-хромосомы.

Хотя существует эффективный механизм стирания «приобретенных» эпигенетических модификаций, не все эпигенетические метки полностью удаляются во время развития половых клеток. Например, метилирование ДНК семейства транспозонов IAP репрограммируется только частично (Lane et al., 2003). Неполное удаление эпигенетических меток, очевидно, может привести к эпигенетическому наследованию через линию половых клеток. И этому имеется ряд примеров у млекопитающих (Chong and Whitelaw, 2004) Чтобы понять, насколько широко этот феномен распространен и сколько генов могут быть в него вовлечены, нужны дальнейшие исследования.

Рис. 20.5. Ранние эпигенетические события во время спецификации половых клеток

^{Экспрессия Blimp1 в потомках эпибластных клеток приводит к подавлению экспрессии соматической генной программы (красный). За этим следует экспрессия Stella, Nanog и Esgl, увеличение H3K27me3, H3K4me3 и H3K9ас, утрата H3K9me2 и 5МеС. Примордиальные половые клетки входят в гонады, после чего происходит дальнейшее эпигенетическое репрограммирование}

2.6. Линия половых клеток и стволовые клетки — обратимый фенотип

Половые и ICM-клетки являются теми клетками, из которых происходят плюрипотентные клетки в культуре. При культивировании в присутствии FGF2 PGC подвергаются изменениям и становятся плюрипотентными эмбриональными половыми (EG) клетками (Matsui et al., 1992; Resnick etal., 1992). Они во многих отношениях сходны с плюрипотентными ES-клетками, за исключением того, что в EG-клетках в процессе их получения происходит интенсивное стирание родительских импринтов (Tada et al., 1998).

Поскольку PGC проявляют свойства плюрипотентности, можно предположить, что существуют механизмы, позволяющие PGC сохранять специфические характеристики разных линий Каким образом это достигается, пока неясно. Возможно, что функция Blimp1 сохраняется после PGC спецификации для ее гарантии. Предполагается, что при получении EG-клеток это ограничение ослабляется и PGC приобретают явные плюрипотентные свойства, в том чисде способность дифференцироваться в разные клеточные типы, что редко происходит с половыми клетками in vivo. Следует заметить, что получение EG становится прогрессивно менее эффективным при использовании PGC со стадий Е11.5 и Е12.5, что также свидетельствует о том, что свойства этих клеток изменяются со стадии Е11.5, когда они начинают дифференцироваться в дефинитивные мужские и женские половые клетки.

2.7. Развитие половых клеток из плюрипотентных ES клеток

Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из бластоцист, могут дифференцироваться во все типы соматических тканей, включая половые клетки (рис. 20.7). Большие усилия прилагаются для эффективного получения из ES-клеток в культуре разных тканей. Недавно было показано, что из культивируемых ES-клеток можно получить PGC и, возможно, спермий- и ооцит-подобные структуры (Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). Следовательно, с углублением знаний о генетической программе спецификации PGC и гамет механизм спецификации половых клеток может быть изучен in vitro. Это, возможно, позволит создать модельную систему для изучения эпигенетического репрограммирования в этой линии клеток. Такой подход, в конечном итоге, поможет пониманию того, что происходит с линией половых клеток у человека Более того, если станет возможной направленная дифференцировка культивируемых ES-клеток человека в ооциты, их можно будет использовать для «терапевтического» клонирования, и, таким образом, отпадет необходимость в донорских ооцитах, которые трудно получать. Эти ооциты могут быть использованы для трансплантации ядер соматических клеток и получения бластоцист, а затем ES-клеток. Ядра соматических клеток, перенесенные в ооциты, подвергаются репрограммированию в тотипотентное состояние (подробно о трансплантации ядер и репрограммировании см. главу 22). Такая процедура, вероятно, окажет огромное влияние на биомедицину, так как позволит создавать «персонифицированные» ES-клетки от больных. Кроме того, она позволит иметь большое разнообразие ES-клеток от больных со специфическими заболеваниями. Такие ES-клетки, в свою очередь, открывают возможность исследовать причины, лежащие в основе заболеваний человека. Они могут быть использованы, например, для тестирования терапевтических препаратов, купирующих болезнь.

Использование человеческих эмбрионов и ES-клеток в исследованиях и терапии поднимает много этических проблем. В различных странах существуют законодательства и руководства для исследований в этой области. Если получение жизнеспособных гамет из ES-клеток человека станет возможным и они будут способны к оплодотворению и дальнейшему развитию, это поднимет новые этические вопросы о том, может ли такой подход быть использован в медицине и каким образом.

2.8. От примордиальных половых клеток к гаметам

Следующим этапом в развитии линии половых клеток является начало гаметогенеза и вступление половых клеток в мейоз. Соматическое окружение в гонадах регулирует время этого события. У самок половые клетки останавливаются в мейотической профазе, в то время как у самцов половые клетки останавливаются в митозе. Многие сигналы окружающей среды диктуют, войдут ли половые клетки в мейоз или нет. Недавно был идентифицирован новый ген Meisetz и было показано, что он играет важную роль в инициации мейоза (Hayasshi et al., 2005). Этот ген также содержит SET/PR и многочисленные «цинковые пальцы», которые, как было установлено, каталитически активны по отношению к H3K4те. Экспрессия Meisetz специфична для половых клеток и обнаруживается во время входа их в мейотическую профазу у самок на стадии Е13.5 и в постнатальных семенниках. Мутация в гене Meisetz приводит к стерильности и самцов, и самок, что свидетельствует о его важной роли в половых клетках. В мутантных половых клетках наблюдается заметное нарушение в репарации двухнитевых разрывов ДНК и спаривании гомологичных хромосом во время мейоза. Эти исследования демонстрируют важную роль эпигенетических механизмов в половых клетках во время мейоза.

Обширные эпигенетические изменения продолжаются во время гаметогенеза и, в конце концов, соматические линкерные гистоны заменяются вариантами, специфичными для семенников (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005), а затем происходит замена большинства гистонов на протамины. Исследования показали, что в репрессию генов и хромосомное спаривание вовлечены Suv39 и H3K9 метилтрансфераза. Кроме того, два белка, Suv39hln Suv39h2, имеющие SET-домен, имеют важное значение для мужских половых клеток, причем последний экспрессируется преимущественно в семеннике, накапливаясь в половом тельце. Мутации в Suv39hln Suv39h2 приводят к стерильности, поскольку происходит остановка спемаююниальных клеток (Peters et al., 2001). В мужских половых клетках присутствует также хроматоидное тельце, облакоподобная цитоплазматическая структура. Она является цитоплазматической органеллой, специфичной для половых клеток, которая взаимодействует с ядром, содержит компактную мРНК и является РНК-процессинговым тельцем, содержащим белки Dicer и Argonaute и микроРНК.

В самообновление стволовых клеток половой линии вовлечены некодирующие РНК в сперматогенезе, роль которых, возможно, опосредована механизмом интерференции РНК (и PHК) и гистон метилтрансферазами (НМТазы). Сообщалось, что члены семейства Piwi/Argonaute (у мышей они называются М/м) играют роль в явлении иРНК. Утрата Miwi-подобных белков (Mili) приводит к стерильности у мышей (Kuramochi-Miyagawa et al., 2004), вызывая высокий уровень транскриптов ретротранспозонов IAP и Linel Однако напрямую вовлечение Miwi-подобных белков в их репрессию показано не было.

Недавние исследования продемонстрировали возможность получения плюрипотентных стволовых клеток из спематогониальных стволовых клеток семенников новорожденных и даже взрослых животных (Kanatsu-Shinohara et al, 2004; Guan et al., 2006). Такие клетки можно постоянно поддерживать в культуре, но в отличие от ES-клеток они имеют родительский (андрогенный) импринт. Эти клетки способны дифференцироваться в разные соматические клетки in vitro и in vivo и являются жизнеспособными половыми клетками in vivo. Такие клетки должны стать важным объектом для изучения разных аспектов сперматогенеза и роли эпигенетических механизмов, которые регулируют их свойства как стволовых клеток и дифференцировку в мужские половые гаметы

Стирание импринтов в ранних половых клетках делает родительские хромосомы эпигенетически эквивалентными, что происходит в первый и последний раз в жизни млекопитающих. Трансплантация таких «свободных от импринтов» ядер непосредственно в ооциты приводит в развитию аберрантных эмбрионов, которые погибают на ранних эмбриональных стадиях, вероятно вследствие того, что из-за отсутствия соответствующих эпигенетических модификаций происходит нарушение экспрессии генов, которые в норме подвергаются импринтингу. Этот эксперимент также показывает, что импринты не могут приобретаться ядрами без импринтов при их трансплантации непосредственно в ооцит. ДНК метилирование импринтов начинается после рождения в процессе роста ооцитов из женских половых клеток. В мужских половых клетках это происходит на более поздних стадиях эмбриогенеза. В этом процессе важную роль играют de novo Dnmt3a метилтрансфераза и ее кофактор Dnm3L (детали см. в главе 19). Импринтинг является главным барьером партеногенетического развития у млекопитающих. Попытки манипулировать эпигенотипом женских гамет, возможно, позволят получать у млекопитающих эмбрионы полностью материнского происхождения.

3. От ооцитов к раннему эмбриону

В предыдущих разделах мы рассмотрели, как зрелые спермии и ооциты приобретают различные специфические эпигенетические метки во время гаметогенеза. Некоторые из этих различий, такие как родительские импринты, точно поддерживаются в эмбрионах после оплодотворения. Многие другие репрограммируются, поскольку геном эмбрионов приобретает тотипотентность. Важно знать, какую роль играют эпигенетические метки, унаследованные от родительских гамет, на самых ранних этапах дифференцировки эмбрионов. Если вы начинаете жизнь с одной клетки (оплодотворенная зигота) с полным геномом, которая затем делится, как вы достигаете различий в генной экспрессии и программах развития в дочерних клетках?

3. 1. Материнская наследственность и потенциальное асимметричное распределение?

У организмов (таких как дрозофила, шпорцевая лягушка, цыпленок), у которых яйцеклетка имеет большой размер, некоторые материнские белки и РНК располагаются в яйце ассиметрично Они наследуются только некоторыми клеточными потомками, которые впоследствии имеют особую судьбу, в то время как другие потомки, не унаследовавшие эти детерминанты, развиваются по-другому (Huynh and St Johnston, 2004). Такая стратегия возможна для относительно больших яйцеклеток (таких, как у дрозофилы), но затруднительна для млекопитающих с более мелкими яйцеклетками. Однако программа развития может диктоваться не только размерами яйцеклеток, но, что более важно, необходимостью формировать бластоцисту у млекопитающих, которая должна имплантироваться и образовывать плаценту для поддержания эмбриона. С точки зрения развития, ICM можно считать эквивалентной ооциту дрозофилы, поскольку их онтогенетичекое разнообразие на начальных этапах развития регулируется сигналами из экстраэмбриональной соматической ткани. Хотя недавно появились предположения, которые связывают симметрию оплодотворенной зиготы с симметрией бластоцисты и даже постимплантационных эмбрионов (Gardner et al., 1997; Weber et al., 1999), никаких детерминант дифференцировки, ассиметрично расположенных в яйцеклетке, у млекопитающих пока не найдено. Более того, эмбрионы млекопитающих обладают удивительной способностью «регулировать» развитие, т. е. если удалить или нарушить клетки, компенсаторный рост или клеточные движения позволяют поддерживать нормальное развитие эмбриона (Kelly, 1977). Тем не менее, небольшие различия в предрасположенности индивидуальных клеток (бластомеров) развиваться в ICM и ТЕ линии, вероятно, существуют уже на четырехклеточной стадии (Fujimori et al., 2003; Piotrowska-Nitsche et al., 2005).

3.2. Эпигенетические события при оплодотворении

Во время развития и дифференцировки клетки соматических линий приобретают специфическое и специализированное ДНК метилирование и модифицирование гистонов. Эти модификации, по-видимому, трудно стереть или обратить при пересадке соматических ядер в ооциты (глава 22). Эпигенетические метки в ооцитах и спермиях также специализированы, но они репрограммируются при оплодотворении таким образом, что геном эмбриона приобретает новую функцию, а именно становится тотипотентным (Reik et al., 2001; Surani, 2001). Известен ряд характеристик эпигенетического рисунка гамет и генетического репрограммирования после оплодотворения (рис. 20.2). Геномы и спермиев, и ооцитов имеют высокий уровень метилирования ДНК. Как пример особого класса последовательностей можно привести семейство ретротранспозонов, внутринистерные А частицы (intracistemal A particles, IAP), число копий которых в мышином геноме составляет около 1000 и которые имеют высокий уровень метилирования и в ооцитах, и в спермиях (Lane et al., 2003). Однако имеются определенные последовательности, особенно дифференциально метилированные районы (differentially methylated regions, DMR) в импринтных генах, которые являются метилированными только в ооцитах или спермиях (глава 19).

Геном ооцитов имеет высокий уровень модификаций гистонов, как активных (например, H3K9 ацетилирование, H3K4 метилирование), так и репрессивных (H3K9, H3K27 метилирование) (Morgan et al., 2005). Перед оплодотворением геном ооцита транскрипционно неактивен. Однако в ооците содержатся транскрипты и белки, необходимые для первых нескольких делений дробления, в том числе те, которые имеют важное значение для репрограммирования (рис. 20.1а). Геном спермия высоко специализирован, поскольку большинство гистонов во время сперматогенеза заменилось на протамины, способствующие, по-видимому, упаковке ДНК в компактную головку спермия (McLay and Clarke, 2003). В настоящее время неизвестно, какие модификации есть в оставшемся хроматине и где они раположены, что создает трудности для изучения этих немногочисленных районов хроматина.

Вскоре после оплодотворения в геноме спермия происходит четко отрегулированное репрограммирование. Протамины замещаются гистонами. Вероятно, будучи независимым от репликации (RI, replication independent), это состоит во включении гистонового варианта H3.З гистоновым шапероном HIRA (van der Heijden et al, 2005; см. гл 13). В то время в мужском пронуклеусе происходит обширное ДНК метилирование, затрагивающее как однокопийные последовательности, так и повторы, но не мужские метилированные импринтные гены (Olek and Walter, 1997; Mayer et al., 200; Oswald et al., 2000; Dean et al., 2001; Santos et al., 2002; Lane et al., 2003).

В мужском пронуклеусе перед репликацией ДНК H3 и Н4 гистоны ацетилированы, H3K4 метилирован; быстро появляются H3K9те и H3K27mel (Amey et al, 2002; Santos et al.. 2002; Lepikov and Walter, 2004). Однако H3K9me2/3 и H3K27me2/Зпоявляются только после репликации ДНК, по всей видимости, вместе с включением коровою гистона Н3.1 вместо H3.З (Santos et al., 2005). Во время первого митоза большинство проанализированных к настоящему времени гистоновых меток в женских и мужских хромосомах становятся очень схожими, по крайней мере, на низком уровне разрешения с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания (Santos et al., 2005).