Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Соматические DMRs возникают реже и были описаны лишь на нескольких импринтированных кодирующих белки генах в каждом кластере, что указывает на то, что метилирование ДНК может играть лишь ограниченную роль в поддержании экспрессии импринтированного гена (Stoger et al., 1993; Moore et al., 1997; Yatsuki et al., 2002). Делеции гаметических DMRs у мышей приводят к полной утрате импринтинга для множественных генов, доказывая тем самым, что этот класс DMRs служит также как основной ICE для всего кластера (рис. 19.6) (Wutz et al., 1997; Thorvaldsen et al., 1998; Bielinska et al., 2000; Fitzpatrick et al., 2002; Lin et al., 2003; Williamson et al., 2006). Напротив, делеция соматических DMRs влияет на экспрессию связанного импринтированного гена, кодирующего белок, но импринтированная экспрессия поддерживается другими генами в кластере (Constancia et al.; Sleutels et al., 2003).

Нехватка метилирования ДНК по всему геному, вызываемая мутациями в генах семейства Dnmt, подчеркивает его существенную роль в регулировании экспрессии импринтированного гена. Мутации в de novo метилазе Dmnt3a, в факторе Dmnt3L, стимулирующем метилазу, или в поддерживающей метилазе Dmnt1 дают дефектных по метилированию ДНК эмбрионов, все из которых обнаруживают изменения в экспрессии импринтированных генов (глава 18). Нарушения того типа, который был показан для четырех импринтированных кластеров (Igf2, Igf2r, Kcnq1 и Dlk1), показывает, что метилирование ДНК обычно действует, супрессируя действие гаметического DMR на той же родительской хромосоме, которая экспрессирует собранные в кластер гены и РНК. Таким образом, в отсутствие метилирования ДНК гаметический DMR не может функционировать должным образом. Вследствие этого несколько импринтированных генов, кодирующих белки, в том числе Igf2, Igf2r, Kcnq1 и Dlk1, становятся репрессированными на обеих родительских хромосомах. Это показывает, что эти гены и РНК в геноме млекопитающих сайленсированы «по умолчанию» и требуют активации для своей экспрессии. Примечательно, что ncRNA Н19, которая в норме экспрессируется лишь на хромосоме, несущей неметилированный гаметический DMR, становится экспрессируемой на обеих родительских хромосомах (глава 18) Некоторые исключения из этого общего правила сообщались для генов, демонстрирующих импринтированную экспрессию только в плаценте (Lewis tu al., 2004).

Используются ли другие типы эпигенетических модификаций в качестве гаметических импринтов? При явном изобилии эпигенетических механизмов, действие которых модифицирует генетическую информацию в геноме млекопитающих (описаны в главе 3), маловероятно, чтобы метилирование ДНК было единственным импринтирующим механизмом. Модификации гистонов, влияющие на состояния активности хроматина, также являются вероятными кандидатами на роль родительских импринтов, поскольку они могли бы выполнять многие условия, показанные на рис. 3. На сегодняшний день, однако, показано, что лишь белок — компонент группы Polycomb, известный как Eed (который облегчает метилирование лизина 27 гистона H3), влияет на несколько отцовски-репрессированных генов. Однако влияние Eed на геномный импринтинг довольно незначительно по сравнению с метилированием ДНК, и это может служить лишь функцией поддержания (Mager et al., 2003).

Каким образом DMRs выбираются механизмом гаметического метилирования? Сравнение известных гаметических DMRs по нуклеотидным последовательностям не выявляет сколько-нибудь явного консерватизма последовательностей, хотя сообщалось, что некоторые из них содержат ряд прямых повторов, которые могут приобретать вторичную структуру, привлекающую метилирование ДНК (Neumann et al., 1995). Нуклеотидная последовательность DMRs заметно богаче CpG, чем остальной геном, и напоминает последовательность островков CpG, связанную с промоторами более чем половины генов в геноме млекопитающих (глава 18). Поразительно, что ключевой особенностью промоторов с островками CpG является то, что в норме в них отсутствует метилирование ДНК и что в ранних эмбриональных клетках существуют механизмы для поддержания островков CpG промотора свободными от метилирования (Antequera, 2003). Однако в опухолях и при старении островки CpG могут становиться метилированными.

Два наблюдения пролили свет на то, каким образом метилирование ДНК могло бы «нацеливать» последовательности DMR. Первое наблюдение заключается в том, что отцовская специфичность метилирования в гаметическом DMR Н19 зависит от предотвращения метилирования «по умолчанию» в этом районе в материнской гамете с помощью белка CTFC (Fedoriw et al., 2004; смотри также раздел 3.6). Это может указывать на отсутствие сиквенс-специфичности системы метилирования ДНК. Второе наблюдение заключается в том, что вспомогательный белок метилирования, Dnmt3L, играет разные роли в мужских и женских гаметах. В мужских гаметах Dnmt3L играет главную роль в метилировании и сайленсинге ретротранспозонов и незначительную роль в метилировании DMR. Напротив, в ооцитах Dnmt3L играет основную роль в метилировании DMR и не играет никакой роли в метилировании ретротранспозонов (Bourc’his and Bestor, 2006). Ретро-транспозоны являются мобильными генетическими элементами, присутствующими в очень большом числе в геноме млекопитающих и могут копироваться посредством промежуточных РНК и вставляться в новые геномные сайты (Kazazian, 2004). Обнаружение того факта, что тот же самый белок, который направляет метилирование, чтобы сайленсировать ретротранспозоны, может также направлять метилирование DMR, показывает, что механизмы, нужные для защиты генома от чужеродных ДНК, были использованы, чтобы делать импринты в материнской зародышевой линии (Barlow, 1993).

3.6. Два типа cis-действующего сайленсинга, идентифицированного в кластерах импринтированных генов

В настоящее время предполагается, что импринтингом в разных кластерах управляют два класса cis-действующих механизмов сайленсинга: это модель инсулятора, приложимая к кластеру Igf2, и модель опосредованного ncRNA сайленсинга, приложимая к кластерам Igf2r и Kcnq1. Хотя это еще не полностью определено, большинство кластеров, перечисленных в табл. 19.2, демонстрируют те или иные аспекты одной из двух моделей. Прорывом, приведшим к определению модели инсулятора в локусе Igf2, была делеция гаметического DMR, который локализован на расстоянии 2 т. о. «вверх по течению» от старта транскрипции Н19 и на расстоянии 80 т. о. «вниз по течению» от Igf2 (рис. 19.7) (Thorvaldsen et al., 1998). Будучи делетированы, Н19 и lgf2 обнаруживали утрату импринтинга безотносительно к тому, наследовалась ли эта делеция от матери или от отца, что позволяло идентифицировать этот DMR как ICE. Впоследствии было показано, что этот ICE связывается с CTCF — белком, который, как было показано, опосредует активность инсулятора в локусе beta-globin, и что сам ICE фунционирует как инсулятор (Bell and Felsenfeld, 2000; Hark et al., 2000). В этом контексте инсулятор определяется как элемент, который блокирует взаимодействия промотора и энхансера, будучи помешен между ними Таким образом, модель экспрессии импринтированного гена в этом локусе следующая: на материнской аллели CTCF связывается с ICE и блокирует доступ lgf2 и Ins2 к энхансерам, общим с ncRNA Н19, которые расположены «вниз по течению» от этих трех генов. Тем самым это предоставляет Н19 исключительный доступ к энхансерам (рис. 19.7). На отцовской аллели ICE приобретает метилирование ДНК в мужской зародышевой линии, предотвращая связывание CTCF с ним. Таким образом, на отцовской хромосоме Igf2 и Ins2 взаимодействуют с энхансерами и экспрессируются с этой хромосомы. Присутствие метилирования ДНК на отцовском ICE ведет ко вторичному метилированию промотора Н19 с помощью неизвестного механизма, и он становится сайленсированным на отцовской хромосоме. Участие CTCF в модели инсулятора привело к идентификации сайтов связывания CTCF в других импринтированных генах, таких как Rasgrfl, GrblOw Kcnq1otl, показывая тем самым, что модель инсулятора может работать в других импринтированных кластерах.

Рис. 7. Два cis-действующих механизма сайленсинга в кластерах импринтированных генов

^{(а) Модель инсулятора для кластера Igf2. Показан паттерн экспрессии для эндодермы. На материнской хромосоме неметилированный ICE связывается с белком CTFC и формирует инсулятор, который не дает общим энхансерам эндодермы (Е) активировать Igf2 и Ins2. Вместо этого эти энхансеры активируют близлежащий промотор ncRNA Н19. На отцовской хромосоме метилированный ICE не может связываться с СТСЕ и инсулятор не образуется, вследствие чего гены иРНК Igf2 и Ins2 экспрессируются только на этой хромосоме. ncRNA Н19 метилируется, скорее всего, из-за распространения с удаленного на 2 т.о.метилированного ICE и является «молчащей», (б) модель ncRNA для кластера Igf2r. Показан паттерн экспрессии для плаценты. На материнской хромосоме метилированный ICE содержит промотор ncRNA Air, который прямо сайленсирован импринтом метилирования ДНК. Гены иРНК Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 экспрессируются только на этой хромосоме. Mas1 и Slc22a1 в плаценте не экспрессируются. На отцовской хромосоме промотор ncRNA Air, лежащий в неметилированном [СЕ, экспрессируется и сайленсирует Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 в cis. Заметьте, что в обеих моделях импринт метилирования ДНК сайленсирует ncRNA и делает возможной экспрессию иРНК: (ICE) — элемент контроля импринта (серый прямоугольник) — импринтированный ген иРНК, (ген-NC) — импринтированный ген ncRNA, (стрелка) экспрессированная аллель импринтированного гена, (черный запрещающий знак) — репрессированная аллель импринтированного гена, (заполненный ромб) — тканеспецифичныи ген, сайленсированныи на обеих родительских хромосомах, (серые стрелки) — удаленный эффект в cis-конфигурации}

ncRNA-класс моделей импринтинга может, однако, быть более обычным. Прорывом, приведшим к идентификации функциональных ncRNAs в импринтированных кластерах, явился эксперимент с укорочением ncRNA Air, имеющей длину 108 т. о., до 3 т. о. (Sleutels et al., 2002). Эта укороченная ncRNA сохраняла импринтированную экспрессию, и промотор Air сохранял импринтированное метилирование ДНК — тем не менее, сайленсинг всех трех генов иРНК в кластере Igf2r был утрачен (рис. 19.7). Сейчас было показано, что сайленсинг, опосредованный ncRNA, действует также в кластере Kcnq1 (Mancini-DiNardo. 2006) В настоящее время неизвестно, каким образом ncRNA Air или Kcnq1ot1 сайленсируют гены в соответсвующих импринтированных кластерах. Возможны многие модели, применимые к обоим кластерам. Две возможности возникают из факта перекрывания смысловой и антисмысловой последовательности иРНК и ncRNA, имеющего место в каждом кластере. Первая возможность заключается в том, что между иРНК и ncRNA может образовываться двунитевая РНК и индуцировать РНК-интерференцию (RNAi) (глава 8). Вторая возможность состоит в том, что это перекрывание смысловой и антисмысловой последовательности становится причиной одной из форм транскрипционной интерференции между двумя промоторами, которая затрагивает лишь транскрипцию с промотора иРНК. В обоих этих случаях первым событием был бы посттранскрипционный сайленсинг перекрывающейся иРНК, сопровождаемый накоплением репрессивного хроматина, способного распространяться и индуцировать транскрипционный сайленсинг генов во всем кластере.

Однако возможно также, что импринтированные ncRNAs действуют, покрывая локальный участок хромосомы и непосредственно рекрутируя репрессивные белки хроматина к репрессированному кластеру примерно таким же образом, как это описано для действия ncRNA Xist в инактивации Х-хромосомы (глава 17). Имеет место большое сходство между сайленсингом, опосредуемым импринтированной ncRNA, и сайленсингом, опосредуемым ncRNA Xist. Наиболее существенно, что оба эти случая представляют cis-действующие эпигенетические механизмы сайленсинга и оба демонстрируют положительную корреляцию между экспрессией ncRNA и сайленсингом множественных генов иРНК. Предположили также, что геномный импринтинг и Х-инактивация развились из общего эпигенетического механизма (Reik and Lewis, 2005). Если бы это было так, можно было бы предсказать, что импринтированные ncRNAs могут сайленсировать гены путем «нацеливания» репрессивного хроматина на кластер импринтированных генов Однако у нас все еще нет четкой информации относительно того, как импринтированные ncRNAs осуществляют свою сайленсирующую функцию. И мы все еще не знаем, сколько других импринтированных ncRNAs также играют функциональную роль в сайленсинге генов.

4. Геномный импринтинг — модель эпигенетической регуляции у млекопитающих

Геномный импринтинг имеет преимущество перед другими моделями эпигенетического регулирования генов у млекопитающих, поскольку и активная, и неактивная родительские аллели расположены в одном и том же ядре и находятся в одной и той же транскрипционной среде. В результате любое эпигенетическое различие между этими двумя родительскими аллелями должно с большей вероятностью коррелировать с их транскрипционным состоянием в противоположность эпигенетическим системам типа «до и после» [«before and after» epigenetic systems], где эпигенетические изменения могут также отражать измененное состояние дифференцировки клетки. Присутствие и активной, и «молчащей» родительской аллели в одном и том же ядре делает геномный импринтинг идеальной системой для изучения эпигенетической регуляции генов, но и создает некоторые трудности, поскольку необходимо сначала отличить одну из родительских аллелей, чтобы идентифицировать специфические особенности, связанные с активностью и сайленсингом генов. Эти трудности были в основном преодолены у мышей в связи с разработкой модельных систем, позволяющих различать материнские и отцовские хромосомы (рис. 19.1).

Несмотря на тот факт, что пути эпигенетической регуляции генов весьма консервативны в эволюции, для каждого организма должны, вероятно, существовать отличия, связанные с типом организации генома. Геном млекопитающих демонстрирует необычную организацию. где гены чередуются [intersperse] с высококопииными повторами (известными также как перемещаемые элементы). Это существенно увеличивает длину большинства генов, как и расстояние между соседними генами Kazazian, 2004). Это контрастирует с другими модельными организмами, такими как дрожжи, инфузории, грибы, нематоды, растения и Drosophila, геномы которых обнаруживают тенденцию оставаться свободными от повторов или, по крайней мере, отделять повторы от генов (Rabinovicz et al., 2003).

Было замечено, что у многих организмов высоко-копийные повторы привлекают метилирование ДНК и репрессивные модификации гистонов. Полагали, что это является, главным образом, защитной адаптацией против вторжения нуклеотидных последовательностей чужеродной ДНК (т. е., ретропозонов, транспозонов и вирусов). При обсуждении того, каким образом эпигенетические механизмы действуют у млекопитающих необходимо, следовательно, принимать во внимание эту «перемежающуюся» природу повторов и генов (Goll and Bestor, 2005). Примечательно, что то обстоятельство, что интроны млекопитающих богаты повторами и, тем не менее, гены способны весьма интенсивно транскрибироваться, делает менее вероятным, что геном млекопитающих организован в крупные блоки «молчащего» гетерохроматина или активного эухроматина. Этот взгляд получает некоторую поддержку при анализе паттернов хроматина у человека в масштабах всего генома, который показывает, что активные модификации гистонов обычно ограничены промоторами или короткими участками, предположительно являющимися регуляторными элементами (Kim et al., 2005). Расположение импринтированных генов кластерами, которые содержат реципрокно экспрессируемые перекрывающиеся гены, а также гены, вовсе избегающие импринтинга, говорит в пользу возникающего в последнее время представления о том, что модификации хроматина в геноме млекопитающих могут не распространяться сколько-нибудь далеко.

Что может дать геномный импринтинг для понимания эпигенетики млекопитающих? Хотя характеристика кластеров импринтированных генов далека от завершения, они явно могут дать информацию о том, как гены контролируются в локальных участках или доменах. На сегодняшний день кластеры импринтированных генов уже дали примеры сА-действующих нуклеотидных последовательностей ДНК, которые регулируются метилированием ДНК; генов, которые сайленсируются «по умолчанию» в геноме млекопитающих и требуют эпигенетической инактивации для своей экспрессии; удаленных регуляторных элементов, которые могут действовать как инсуляторы, и необычных ncRNAs, которые сайленсируют крупные домены генов в cis-конфигурации. Время покажет, являются ли эти типы эпигенетических регуляторных механизмов уникальными для импринтированных кластеров или же можно обнаружить, что они регулируют экспрессию неимпринтированных генов в геноме млекопитающих.

5. Направления будущих исследований

Геномный импринтинг вызвал острый интерес со времени открытия первых импринтированных генов у млекопитающих в 1991 году. Некоторые вопросы все еще ожидают окончательных ответов, в особенности те из них, которые касаются того, почему среди позвоночных только млекопитающие используют импринтированные гены для регуляции эмбрионального и неонатального роста Это контрастирует со значительным прогрессом на протяжении последних 15 лет по выяснению эпигенетических механизмов, контролирующих импринтированную экспрессию у млекопитающих. Исходя из этой информации, мы думаем, что понимаем общие принципы того, как механизм импринтинга действует в кластерах импринтированных генов, хотя все детали этого все еще неясны.

На этом этапе мы знаем, что геномный импринтинг использует нормальные эпигенетические механизмы [machinery] клетки для регуляции специфичной в отношении родителя экспрессии и что все приводится в действие путем ограничения этой машинерии в гамете только одной родительской аллелью. Мы знаем, что имеется общее сходство в механизме, контролирующем импринтированную экспрессию разных кластеров генов, но мы все еще не понимаем, сколько вариантов этого механизма существует в геноме млекопитающих.

В будущем мы очень хотели бы знать, в какой степени неимпринтированные гены контролируются эпигенетическими механизмами, описанными для кластеров импринтированных генов. Наконец, нам хотелось бы знать, можем ли мы переносить эти знания на человека для целей терапии; например, индуцируя реэкспрессию «молчащих» генов иРНК у пациентов с синдромом Прадера—Вили и Энгельмана, обнаруживающих дефекты поведения и роста, благодаря делеции хромосомы, несущей экспрессируемые аллели импринтированных генов иРНК (Jiang et al., 2004). Понимание путей, которыми клетка контролирует эпигенетическую информацию, приобретает все более важное значение в свете осознания того, что эпигенетическая регуляция может быть нарушена и при раковых заболеваниях (глава 24), при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (глава 22) и в процессах старения (Egger et al., 2004). Мы ожидаем, что лучшее понимание геномного импринтинга и далее послужит важной моделью для исследования того, как геном млекопитающих использует эпигенетические механизмы для регуляции экспрессии генов.

Благодарности

Мы благодарны бывшим и нынешним сотрудникам лабораторий Барлоу и Бартоломеи (Barlow and Bartolomei) за обсуждение представленных здесь идей. Мы приносим извинения за то, что ограничения числа ссылок не позволили процитировать все оригинальные данные. Наконец, мы очень благодарны Mane-Laure Caparros, Anne Ferguson-Smith, Thomas Jenuwein, Davor Solter и Shirley Tilghman за их замечания к рукописи.

Литература

Antequera E, 2003. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol. Life Sci. 60: 1647–1658.

Barlow D.R, 1993. Methylation and imprinting: From host defense to gene regulation? Science 260: 309–310.

Barlow D.R, Stoger R., Herrmann B.G., Saito K., and Schweifer N., 1991. The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus. Nature 349: 84–87.

Bartolomei M.S., Zemel S., and Tilghman S.M., 1991. Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature 351: 153–155.

Bartolomei M.S., Webber A.L., Brunkow M.E., and Tilghman S.M., 1993. Epigenetic mechanisms underlying the imprinting of the mouse H19 gene. Genes Dev. 7: 1663–1673.

Barton S.C., Surani M.A., and Norris M.L., 1984. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311: 374–376.