Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Ферментативная активность, ответственная за ранние этапы репрограммирования, вероятно, уже присутствует в ооците в виде белков или молекул РНК, которые могут быстро транслироваться. Мы уже упоминали HIRA, но после репликации ДНК участвует CAF-1, который необходим для включения зависимого от репликации (RD, replication dependent) Н3.1. Su (var) ферменты метилируют H3K9, a Ezh2 вместе с его кофактором Eed метилируют H3K27 (Eehardt et al. 2003; Santos et al, 2005). Вероятно, существенное деметилирование ДНК мужского генома вызывается процессом «активного деметилирования», для которого предложены различные механизмы, однако определенного фермента (ферментов) пока не изолировано (Morgan et al, 2005). Возможным кандидатом для участия в механизме деметилирования является семейство ферментов Aid/ Apobec, способных дезаминировать 5-метилцитозин в ДНК, превратив его в тимидин. Возникающее T: G несоответствие может репарироваться за счет механизма репарации с помощью эксцизии оснований (Morgan et al., 2004). У растений процесс деметилирования также включает зксцизионную репарацию, которая инициируется ДНК гликозилазой Demeter (Gerhing et at, 2006). Подобные деметилазы могут присутствовать и в цитоплазме ооцита при оплодотворении. Отсюда возникает вопрос, почему материнский геном не деметилируется одновременно с отцовским? Материнский хроматин или пронуклеус должны обладать неким механизмом специфической протекции; колокализация метилированной ДНК в материнском пронуклеусе вместе с H3K9me2 дает основание предполагать, что эта модификация гистона и есть кандидат для протекции (Amey et al., 2002; Santos et al., 2002, 2005).

Хотя имеющиеся данные предполагают, главным образом, приобретение гистонами модификаций, а не их утрату на глобальном уровне в этот период, возможно, что метилирование гистонов по аргинину является более динамичным. Действительно, в ооцитах присутствует Padi4, кандидат на вырезание метилированных аргининов в гистонах с помошью «леаминирования» (Sacramento et al., 2004).

Представляется, что основной результат быстрых изменений хроматина при оплодотворении заключается в том, что на двухклеточной стадии отцовский геном становится схожим с материнским. Это исключает метилирование ДНК, которое значительно отличается у двух геномов, в основном вследствие деметилирования генома спермиев. Кроме того, проведенный анализ не исключает, что на этой стадии устанавливается геноспецифические различия в модификации гистонов.

3.3 От зиготы к бластоцисте

Дальнейшее репрограммирование, в частности ДНК метилирование по всему геному, продолжается от двухклеточной стадии через стадию дробления преимплантационного развития до достижения эмбрионом стадии бластоцисты (Monk et al. 1987; Howlett and Reik, 191; Rougier et al., 1998). Точная динамика модификаций гистонов у мышей пока не описана, однако метилирование ДНК постепенно уменьшается с каждым клеточным делением до стадии 16-клеточной морулы. Причина заключатся в том, что Dnmtl, метилтрансфераза, которая полуконсервативно поддерживает метилирование CpG динуклекотидов во время репликации ДНК, исключается из ядра (Carlson et al., 1992). Следовательно, при каждом делении теряется 50 % всей геномной метилированной ДНК. Единственным, хорошо документированным исключением из этого являются DMR в импринтных генах. Не ясно, поддерживается ли их метилирование в этот период неизвестной Dnmt или за счет небольшого количества Dnmtl, способной попадать в ядро и специфически узнавать DMR. Примечательно, что на 8-клеточной стадии Dnmtl белок, по-видимому, появляется в ядре на один клеточный цикл. Если этот Dnmtl белок удалить (с помощью генетического элиминирования в ооците, который обеспечивает большую часть, если не целиком, этого белка, деления дробления), метилирование DMR, действительно, уменьшается на 50 %, что согласуется с представлением о его необходимости для поддержания метилирования в течение только одного цикла репликации (Howell et al., 2001).

На стадии 8—16 клеток наружные клетки морулы уплощаются и становятся эпителиальными. Это явление называют компактизацией и оно является первым внешним признаком дифференцировки эмбрионов млекопитающих. В течение последующих 2–3 делений в моруле происходит кавитация (например, образуется полость) и бластоциста становится различимой по своей внутренней массе (ICM) и наружной трофэктодерме (ТЕ). Клетки ICM формируют все линии эмбриона и плода, в то время как ТЕ клетки дают начало большинству (но не всем) линиям плаценты (экстраэмбриональные линии). Вскоре после этой стадии на поверхности ICM образуется еще один слой эпителиальных клеток, которые являются примитивной энтодермой, клетки которой тоже вносят вклад в развитие плаценты и желточного мешка, но не эмбриона. Известно несколько генетических детерминант распределения этих ранних событий: Oct4, Nanog и Sox2 важны для поддержания клеток ICM, в то время как Cdx2 необходим для детерминации или поддержания ТЕ клеток (Nichols et al.2003; Avilion et al., 2003; Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003; Niwa et al., 2005). В какой степени материнский белок (присутствующий в ооците) или эпигенетическая регуляция этих генов могут вносить вклад в решение судьбы этих ранних клеток, пока не известно (Ferguson-Smith, 2001).

Однако большинство эпигенетических программных событий происходят как раз на этой стадии развития. Клетки ICM приобретают высокий уровень метилирования ДНК, по крайней мере, на основании данных иммунофлуоресценции (красные клетки внутри бластоцисты на левом рисунке титульной страницы), который возникает de novo с помощью метилтрансферазы Dnmt3b (Santos et. al., 2002). Это сопровождается усилением метилирования H3K9 и H3K27 гистонов с помощью G9a, Eset и Ezh2, соответственно (Erhardt et al., 2003). Хотя метилирование ДНК de novo не является критичным для начального этапа становления ICM клеток, метилирование гистонов с помощьюEzh2 и Eset является необходимым: при нокауте любого из этих генов развитие клеток ICM нарушается (CFCarroll et al., 2001; Dodge et al., 2004).

В противоположность увеличению эпигенетических модификаций в ДНК ICM, в ДНК в ТЕ, так же, как и в большинстве клеточных линий поздней плаценты, в основном остается гипометилированной (Chapman et al., 1984; Santos et al., 2002). Считается, что клетки плацентарного типа меньше нуждаются в эпигенетической стабильности, поскольку время их жизни более ограничено по сравнению с плодом, который развивается во взрослый организм.

Помимо этих крупномасштабных эпигенетических событий по всему геному, на этих стадиях также происходит репрограммирование более локус-специфическое. В женских эмбрионах XX на стадии дробления X хромосома, унаследованная от отца, инактивируется и в этом состоянии остается в экстраэмбриональных тканях, т. е. в ТЕ и плаценте (Huynh and Lee, 2003; Okamoto et al., 2005). Однако в ICM инактивированная X хромосома реактивируется, а затем после дифференцировки ICM в различные линии происходит случайная инактивация одной из X хромосом (Мак et al., 2004; более детально см. рис. 17.4). Механистически, импринтная X инактивация в преимплантационном эмбрионе связана с экспрессией некодирующей Xist РНК родительской хромосомы, чье «покрытие» хромосомы, как предполагают, приводит к сайленсингу генов и установлению репрессивных эпигенетических модификаций (Heard, 2004). Во вновь образующихся клетках ICM Xist транскрипция подавляется, репрессивные гистоновые модификации, в конце концов, утрачиваются, и хромосома реактивируется (Мак et al, 2004; Okato et al., 2004). Вскоре после этого происходит случайная X инактивация в клетках эпибласта. В следующем разделе мы покажем, что ES клетки «заморожены» на стадии реактивации X хромосомы и поэтому женские ES клетки содержат две активные X хромосомы.

4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам

4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток

В предыдущей главе мы выяснили, что в зиготе, а затем на стадии дробления и в бластоцисте происходят важные эпигенетические события, в результате чего эпигенетический рисунок в ICM и ТЕ отличается Сейчас мы рассмотрим генетические и эпигенетические свойства культивируемых ранних стволовых клеток, полученных из бластоцисты и более поздних линий, таких как эмбриональные стволовые клетки (Smith, 2001), трофобластные стволовые клетки (TS) (Rossant, 2001), эндодермальные клетки (XEN) (Kunath et al., 2005), эмбриональные половые клетки (EG) (Matsui et al, 1992).

Общим для этих клеточных типов является то, что их можно изолировать из интактных эмбрионов и получить из них культуру при определенных условиях культивирования. Такие культуры можно поддерживать длительное время и в них отсутствуют признаки старения. С ними можно осуществлять генетические манипуляции, затем вводить в живые эмбрионы, где они участвуют в развитии разных линий.

Одним из наиболее важных открытий в эмбриологии млекопитающих в 1980-е годы было развитие методов получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ES) из ICM. ES-клетки, эксплантированные из мышиных бластоцист в культуры, могут поддерживаться длительное время, а затем снова вводиться с помощью микроинъекпий в бластоиисты. Они колонизируют все эмбриональные линии, формируя таким образом химеры (рис. 20.6; Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Наиболее удивительным оказалось то, что потомки ES клеток могут колонизировать линию половых клеток и давать нормальное потомство, которое целиком происходит из генотипа ES-клеток. Это, а также возможность генетической манипуляции с геномом ES клеток с помощью гомологичной рекомбинации (что приводит к генному нокауту) произвело революцию в генетике мыши и сделало мышь генетической моделью организма.

ES-клетки имеют сходные свойства с клетками IСМ/эпибласта, однако имеются и существенные различия, что указывает на то, что они являются «синтетическим» клеточным типом, который, вероятно, не существует в нормальном эмбрионе (по-видимому, это относится и к другим плюрипотентным клеткам) (Smith, 2001).

Рис. 20.6. Получение Es и Ts клеток из бластоцисты

^{ES-клетки получают из клеток внутренней массы (ICM) и они могут поддерживаться в культуре без дифференцировки. Культивируемые клетки могут подвергаться генетическому манипулированию. ES-клетки могут быть введены в бластоцисты и колонизировать все ткани эмбриона, в том числе линию половых клеток, за исключением трофобластных клеток плаценты. TS-клетки получают из клеток трофэктодермы бластоцисты и при введении их в бластоцисты они вносят вклад в развитие клеток плацентарного типа}

Например, для самообновление мышиных ES-клеток требуется Lif/gp130/Stat3 сигналинг, однако эмбрионы с мутацией этого сигнального пути развивают нормальную ICM (Smith, 2001). Вероятно, при получении и поддержании ES из ICM происходят эпигенетические изменения, которые, возможно, являются необходимыми. ICM клетки, растущие в культуре, довольно быстро теряют экспрессию Oct4 и только единственный штамм мышей, 129Sv, из которого относительно легко получить ES-клетки, сохраняет экспрессию Oct4 при культивировании (Buer et al., 2003). Сообщалось также об эпигенетических изменениях в импринтных генах в ES-клетках мыши и макаки; в мышиных клетках это может приводить к нарушению развития клеток в химерах (Dean et al., 1998; Humphreys et al., 2001; Fujimoto et al, 2005).

4.2. Эпигенетические свойства плюрипотентных стволовых клеток

ES-клетки могут дифференцироваться в разные клеточные линии (рис. 20.7). В какой мере эпигенетические механизмы поддерживают клетки в дифференцированном или недифференцированном состоянии? Очевидно, что существуют эпигеномные различия между недифференцированными ES-клетками, дифференцированными ES-клетками и соматическими клетками. Плюрипотентные клетки частично характеризуются гипердинамической пластичностью хроматина (Meshorer et al, 2006). Делеция в ES-клетках Parp (poly-ADP ribosylase, поли-АДФ рибозилаза), которая участвует в контроле изменения гистоновых меток, приводит с низкой частотой ктрансдифференцировке в клетки трофобласта. Это предполагает, что гистоновые маркеры необходимы для поддержания идентичности ES-клеток (Hemberger et al., 2003). Для этого необходимо также ДНК метилирование, поскольку сильная потеря ДНК метилирования приводит к частичному блокированию способности ES-клеток к дифференцировке, а те, которые дифференцируются, экспрессируют маркеры ткани трофэктодермы (Jackson et al., 2004).

Поддержание плюрипотентности ES-клеток зависит от транскрипционных факторов Oct4, Nanog и Sox2 (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Дифференцировка ES клеток in vitro характеризуется подавлением транскрипции плюрипотентных генов, которые репрессированы во всех соматических тканях. Для их молчания важное значение имеют эпигенетические механизмы: промотор Oct4, например, накапливает при дифференцировке репрессивные гистоновые модификации и ДНК метилирование (Feldman et al., 2006). Утрата ДНК метилирования, например, в эмбрионах с нокаутом Dnmtl приводит к репрессии Oct4 при дифференцировке (Feldman et al., 2006).

ES-клетки и их дифференцированные производные служат моделью эпигенетической регуляции инактивации X хромосомы. В женских ES-клетках и ICM Xist ген инактивирован и имеются две активные X хромосомы. При дифференцировке in vitro Xist на одной из X хромосом активируется, Xist РНК начинает «покрывать» эту хромосому в положении cis, в результате чего на сопутствующей хромосоме происходит «молчание» генов, аккумуляция репрессивных гистоновых модификаций и метилирование ДНК (Heard, 2004).

Рис. 20.7. Дифференцировка ES-клеток в различные клеточные типы in vitro

^{ES-клетки при определенных условиях культивирования мо­ гут дифференцироваться в различные типы клеток, такие как нейроны, мышечные клетки и даже половые клетки (ооциты) На вставке показаны нейроглиальные клетки, полученные из ES-клеток в культуре}

Другие плюрипотентные клетки тоже могут быть переведены в культуру, но их эпигенетические свойства охарактеризованы меньше, чем у ES-клеток. Однако из исследований эпигенетической инактивации X хромосомы известно, что в женских TS-клетках имеется отцовская инактивированная X хромосома, содержащая репрессивные гистоновые метки (Hyynh and Lee, 2003). Женские XEN-клетки тоже имеют отцовскую X хромосому, которая инактивирована (Kunath et al., 2005).

Плюрипотентные клеточные линии получают также из примордиальных половых клеток (PGG) либо в период их миграции в эмбрионе (Е8-Е10.5), либо после того, как они оказываются в эмбриональных гонадах (Е11.5-Е13.5) (рис. 20.8) (Matsuietal, 1992). PGG на стадии развития Е8.5-12.5 подвергаются обширному эпигенетическому репрограммированию, включая ДНК метилирование импринтных генов и других последовательностей в геноме (Haikova et al., 2002; Lee et al., 2002). Большинство EG линий подвергается стиранию метилирования ДНК в импринтных генах и других последовательностях и это изменяет их потенциал развития, что обнаруживается при образовании химер (Tada et al., 1998). Пока неясно, имеются ли эпигенетические различия между эндогенными PGG и культивируемыми in vitro EG клетками, подобные тем, которые, как предполагается, сушествуют между ICM и ES-клетками.

4.3. Способность стволовых клеток к репрограммированию

Постоянное поддержание плюрипотентности в культуре без признаков старения вполне возможно требует постоянного эпигенетического репрограммирования стволовых клеток. То, что эти клетки имеют репрограммирующую активность, было показано в экспериментах по слиянию EG или ES-клеток с дифференцированными соматическими клетками (Tada et al., 1997, 2001; Cowan et al., 2005). Было установлено, что в тетраплоидных клеточных линиях, получившихся в результате слияния, соматический эпигенотип был репрограммирован (рис. 20.9). При слиянии EG и соматических клеток соматический геном утрачивал ДНК метилирование импринтных генов, а также других последовательностей в геноме (Tada et al., 1997). Напротив, при слиянии ES-клеток с соматическими ДНК метилирование импринтных генов сохранялось, но инактивированная X хромосома (в женских клетках) реактивировалась, промотор гена Oct4 становился ДНК деметилированным, что приводило к реэкспрессии Oct4 (Tada et al., 2001; Cowan et al., 2005; Surani, 2005).