Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

3. Что такое СО₂-инкубатор и каковы его функции?

4. Каким образом поддерживается стерильность в ламинарном шкафу?

5. Каковы особенности пластика, используемого в стерильной работе с эукариотическими клетками?

6. Опишите расположение вещей в ламинарном шкафу.

7. Как правильно открывать сосуды со стерильными жидкостями внутри ламинарного шкафа?

8. Какую посуду используют для работы с культурами клеток?

Вопросы по теме

1. Перечислите возможные способы стерилизации.

2. Какие основные принципы работы в стерильном помещении должен соблюдать экспериментатор?

3. Опишите особенности стерилизации стеклянной посуды и растворов.

Домашнее задание

Прочитать учебник [Фрешни, 2010]: главу 4, с. 72–84, главы 5 и 6, с. 85–111.

Лабораторная работа 2. Ростовые среды для эукариотических клеточных культур

Цель работы

Получение навыков работы в стерильных условиях в ламинарном шкафу. Подготовка необходимых растворов для культивирования клеток: фосфатно-солевого буфера, раствора Версена и раствора трипсина, полной ростовой среды.

Введение

Базовая среда. Как правило, это готовая коммерческая среда с определенным химическим составом, специально разработанная для выращивания конкретной культуры клеток. Она поставляется в виде готовой стерильной жидкости или сухого порошка. Примером может служить самая распространенная среда Игла (МЕМ и ее модификация DMEM): в нее входят энергетические субстраты (глюкоза, пируват), незаменимые аминокислоты, витамины (биотин, витамины группы В, холин, фолиевая кислота, инозитол). В составе базовой среды также должны быть соли, необходимые для обеспечения осмотического давления, pH, функционирования металлозависимых ферментов и других белков (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl−, SO42−, PO43−, HSO3−).

Полная ростовая среда – это жидкость, в которой есть все компоненты, необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки. Обычно базовую среду дополняют индивидуальными добавками. Для разных культур различается как состав базовой смеси (соотношение солей, содержание источников углерода и энергии, незаменимых аминокислот, витаминов, буферных растворов), так и соотношение дополнительных компонентов (FBS, антибиотики, гормоны, ростовые факторы, дополнительные аминокислоты и витамины).

Аминокислоты. Незаменимые аминокислоты необходимы для жизнедеятельности клеток в культуре. Аминокислоту глутамин часто добавляют отдельно, так как она разлагается при долгом хранении жидкой среды. Для некоторых клеточных линий индивидуально добавляют и заменимые аминокислоты. Если какие-либо культуры или особенности эксперимента предполагают повышенную концентрацию тех или иных аминокислот, их добавляют отдельно.

Сыворотка – фракция крови без форменных элементов – требуется для многих клеточных культур. В зависимости от задачи используют различные варианты: телячью (CS), сыворотку плодов коровы (FBS), часто называемую эмбриональной бычьей сывороткой; сыворотку взрослых лошадей и сыворотку человека.

В состав сыворотки входят следующие компоненты, необходимые для роста клеток в культуре:

• факторы адгезии (фибронектин);

• ростовые факторы: пептиды, необходимые для роста и дифференцировки клеток (например, основной тромбоцитарный фактор роста – PDGF);

• белки, основными из которых являются альбумины, фибронектин (способствует адгезии клеток), макроглобулины (ингибиторы трипсина), трансферрин;

• гормоны.

Антибиотики и антимикотики необходимы для подавления роста единичных клеток бактерий и грибов, случайно попавших в клеточную культуру. Важно отметить, что если экспериментатор начал исследование, используя среду с добавлением антибиотиков и антимикотиков, то их надо применять в течение всей работы, так как они могут влиять на изучаемые клетки.

Дополнительные добавки часто приходится вносить для роста клеток, особенно в первичных культурах. К таким добавкам, в частности, относятся дополнительные факторы роста – обычно используются коммерческие препараты рекомбинантных белков (например, фактор роста фибробластов – FGF, эпидермальный фактор роста – EGF, ангиогенин и др.). Нередко добавляется инсулин для стимулирования поглощения клетками глюкозы.

Для промывания клеток от следов среды или других добавок используют фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или раствор Хенкса (рН 7,4). Макроглобулины ростовой среды ингибируют действие диссоциирующих растворов, необходимых для снятия клеток в адгезионных культурах, и без предварительной промывки этот процесс затрудняется.

Для снятия прикрепленных клеток с культуральной поверхности используют специальные растворы. Раствор Версена содержит натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, которая связывает двухвалентные ионы, необходимые молекулам факторов адгезии в адгезионных культурах.

Изопептидные связи (амидные связи, которые могут образовываться между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой) также способствуют прикреплению клетки к подложке; эти группы разрушают с помощью ферментов. Наиболее часто применяют 0,25 %-ный раствор трипсина.