Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Вряд ли теоретически можно допустить, что сапрофитные грибы, обладающие набором ферментов для разрушения мертвых растительных остатков лесной подстилки, способны осуществлять в корнях растений многочисленные синтетические процессы, поскольку такая универсальность несвойственна микроорганизмам.

Для окончания затянувшейся на несколько десятилетий дискуссии о природе и происхождении грибных симбионтов растений назрела необходимость в разработке метода выделения чистых культур эндофитов с целью установления их морфологии, физиологии, происхождения и сущности взаимосвязи с растениями. Неудачные опыты многих исследователей, предпринимавших попытки решить этот вопрос, заставили нас искать новые пути получения таких культур.

Метод выделения эндофитов. Наша работа по выделению чистых культур эндофитов из корней растений была начата с выяснения надежной стерилизации поверхности корней, не нарушающей жизнедеятельности находящихся внутри них живых организмов. Было установлено, что применение 2-3‑минутной обработки тонких корешков сулемой в концентрации 1 : 1000 и последующая отмывка сулемы спиртом и многократно стерильной водой обеспечивают стерильность поверхности корня и не нарушают жизнеспособности эндофитов. Это же достигается при короткой обработке 30%‑ной перекисью водорода.

Состав питательной среды. После долгих поисков мы остановились на следующей буферной питательной среде (г на 1 л воды): глюкоза — 8; К2НРО4 — 0,3; КН₂Р0₄— 0,9; MgS0₄ — 0,2; K₂SО₄ — 0,1; FeS0₄ и MnS0₄ — следы, аспарагин — 0,01.

Нам удалось также установить основную особенность симбионтных грибов растений — их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду и, как мы увидим дальше, в процессе прорастания из семени в корень, В обоих указанных случаях без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают (Гельцер, 1973а, б). В редких случаях при сильной микотрофности растений и, очевидно, достаточной концентрации гормональных веществ в тканях их корней, а также при небольшом разведении питательной среды эндофиты прорастают без добавления ростовых веществ. Так были получены чистые культуры эндофитов из черники (Freisleben, 1936), корней зеленых орхидей (Wolff, 1926) и из ирисов в наших опытах.

В качестве ростовых веществ могут быть использованы спиртовые вытяжки из различных гименомицетов и фитобактериомицета, который изготовляется из актиномицета (Actinomyces lavendulae), ризосферных бактерий или наших препаратов, изготовленных из эндофитов и получивших авторские свидетельства: Симбионт I (Гельцер, 1973а) и Симбионтм2 (Гельцер, Игнатьев, 1982). Во всех случаях количество добавляемых в питательную среду ростовых веществ должно быть минимальным при экспериментально установленной концентрации препарата.

За исключением указанной особенности эндофитов, нами не выявлено каких–то их особых требований к составу питательных сред. В качестве энергетических веществ эндофиты хорошо усваивают глюкозу, сахарозу и крахмал, но неспособны использовать органические кислоты (кроме янтарной), целлюлозу и лигнин.

Заканчивается подготовка к выделению чистых культур эндофитов внесением в каждую колбочку гормональных веществ (по 2-3 капли препарата Симбионтм1 или других активных веществ). После прорастания мицелия эндофитов, которое происходит через 5-12 суток, для освобождения от корней мицелий пересевают в колбы с указанной питательной средой без добавления гормональных веществ, которые грибы синтезируют сами. Так как эндофиты обладают азотфиксацией, то применение минимальных доз азота сохраняется и для их дальнейших пересевов, чтобы при многолетнем культивировании этих грибов в лаборатории не нарушать их способности использовать атмосферный азот, о чем мы подробно расскажем в главе 3.

Чистые культуры эндофитов. Разработанная методика выделения эндофитов обеспечивает получение их чистых культур из любых растений, т, е. из сильно и слабо микотрофных, а также растений, считающихся не микотрофными из–за того, что визуально в их корнях под микроскопом эндофиты не были обнаружены.

Мы выделили чистые культуры эндофитов из корней следующих водных растений: рдестов (Potamogeton natans L.), тростника (Phragmites communis Trin.), белокрыльника (Calla palustris L.) и рогозы (Tipha latifolia L.). Замедленный рост и слабое наращивание мицелия заметно отличают чистые культуры водных от сильно микотрофных сухопутных растений, описание которых приводится ниже.

Мать–и–мачехa (Tussilago farfara L.). Эндофиты из корней этого растения ежегодно выделялись в нашей лаборатории па протяжении 9 лет и постоянно получались одинаковые результаты. Четко септированный многоклеточный мицелий, заполненный зернистой плазмой, никогда не спороносит. При старении в мицелии образуются круглые везикулярные вздутия (рис. 10), хорошо окрашиваемые анилин–бляу. Мицелий гриба в жидких средах растет погружённо, образуя студенистую массу вначале темно–зеленого цвета, а в дальнейшем — черного. Пигмент не переходит в раствор. Эндофиты, выделенные из молодых завязей этого растения, окрашены в золотисто–желтый цвет, как и его цветок.

Рис. 10. Везикулы о старом мицелии чистой культуры эндофитов из корней мать–и–мачехи

Вишня (Primus cerasus L.). Эндофит из корней вишни ежегодно выделялся в течение 8 лет. Сильно септированный мицелий с гранулированной плазмой золотистого цвета выделяет в раствор пигмент густо–вишневого цвета. Много шарообразных везикул, образующих цепочки. Спороносящие органы не обнаружены. При нагревании до 60° мицелий теряет жизнеспособность. В жидких средах растет погруженно.

Облепиха (Hippophae rharnnoides L.). Чистая культура эндофита 2 года выделялась из клубеньков и корней. Многоклеточный четко септированный мицелий. иногда с веретенообразными клетками, заполненными гранулированной плазмой. Мицелий преимущественно выделяет коричнево–бурый пигмент.

Клевер (Trifolium pratense L.). Отличительной особенностью эндофитов этого растения, ежегодно выделявшихся нами в течение 7 лет, является хрупкость молодого мицелия, который легко обламывается, при этом кусочки гиф накапливаются на дне колбы. Извлеченные стерильным капилляром, такие отрезки гиф в новой питательной среде образуют такой же мицелий с отпадающими отростками. Многоклеточный мицелий клевера синтезирует красный пигмент. Плодоносящие органы не наблюдались.

Пшеница (Triticum vulgare Vill.). Ежегодно выделялись в течение 5 лет эндофиты из корней разных пшениц. Сильно септированный мицелий образует рыхлую массу, обычно окрашенную в красный цвет. При старении на концах гиф образуются везикулярные вздутия. Рост гриба в жидкой среде погруженный. Плодоносящие органы не наблюдались.

Ирисы (Iris germanica L.). Эндофиты из корней растения ежегодно выделяли 8 -лет. Многоклеточный мицелий в начале роста с удлиненными, а в дальнейшем — с почти круглыми клетками, заполненными гранулированной плазмой, при старении образует темно–зеленую слизистую массу. Иногда мицелии был окрашен в розовый цвет, что, очевидно, зависит от сорта растения. Плодовые органы не наблюдались. При нагревании мицелия до 60° он терял свою жизнеспособность.

Любка (Platanthera bifolia Rchb.). Топкие, слабо септированные гифы при старении образуют четко септированный мицелий (рис. 11). Его отличительной особенностью является белый цвет. За 7 лет выделении эндофитов только один раз мицелий был окрашен в черный цвет. При погруженном росте плодоносящие органы не наблюдались.

Рис. 11. Мицелии чистой культуры эндофита из корней любки

Вереск (Calluna vulgaris Salisb.). Эндофит этого растения выделялся б лет. Четко септированный мицелий, заполненный гранулированной плазмой, растет погружен но. При старении гифы темнеют и приобретают, как и у всех сильно микотрофных растении, темно–зеленый или черный цвет. Эпдофит, выделенный из цветущей ветки этого растения, синтезировал фиолетовый пигмент. В остальном все так же, как у вышеописанных культур.

Можно было бы представить более 100 подобных описаний чистых культур эндофитов, в которых варьировала бы окраска пигментов и их способность переходить или не переходить в раствор. Эндофиты синтезируют пигменты всех цветов. Так, гриб, выделенный из герани, всегда окрашивался в желтый цвет, но однажды оказался фиолетовым. Выяснилось, что эта герань цвела фиолетовыми цветами.

Общими морфологическими показателями для всех выделенных чистых культур эндофитов были следующие: 1) отсутствие спороносящих органов размножения; 2) многоклеточный мицелий, принимающий по мере старения четко септированную форму с везикулярными расширениями; 3) гранулированная плазма, рассыпающаяся при разрыве оболочки клетки; 4) погруженный рост в жидкой среде при отсутствии поверхностного мицелия; 5) способность синтезировать пигменты разных цветов.

Отличие в развитии мицелия у водных растений заключалось в крайней медлительности их роста в первый год выделения в питательных средах. Только после многих пересевов на протяжении года в богатых углеводами средах они уже ничем не отличались от симбионтных грибов сухопутных растений. Создавалось впечатление, что в корнях водных растений эндофиты голодали и понадобился год частых пересевов в богатых углеводами питательных средах для того, чтобы придать им характерную форму, обычную для эндофитов сухопутных растений.

Разработанная методика получения чистых культур настоящих эндофитов открывает широкие возможности для развития науки о симбиотрофном существовании растительного мира. Ее применение способствует устранению многих спорных вопросов, обременяющих изучение грибного симбиоза растений.

Во введении к разделу об эндотрофной микоризе Дж. Харли (1963, с. 134) сообщает, что «наиболее ярким признаком, позволяющим разделить все типы эндотрофной микоризы на две большие группы является членистость (септированность) их гиф. Гифы могут быть септированными, как у аскомицетов, несовершенных грибов и базидиомицетов, или, наоборот, несептированными, например, у фикомицетов». Это утверждение как бы обобщает выводы различных авторов по данному вопросу, поскольку одни твердо убеждены, что эндофиты принадлежат к фикомицетам, а другие — к несовершенным грибам гифомицетам. Никто из авторов не установил, что определенным семействам растений соответствует один из двух указанных видов грибов. Напротив, дли семейства злаковых растении одни исследователи отмечали наличие септированного мицелия, а другие — несептированного. Очевидно, это расхождение определялось тем, что авторы выделяли из корней пшениц разные грибы. Мы всегда наблюдали в корнях всех растений у хорошо развитого мицелия только многоклеточное строение эндофитов, что подтвердилось при выделении их чистых культур.

При микроскопическом изучении выявление перегородок у мицелия эндофитов, растущих в тканях растений, представляет известные трудности даже после мацерации препаратов в щелочи. В молодых гифах перегородки плохо просматриваются в препаратах. В старых гифах, образующих клубки и петли, они видны отчетливо. Дж. Харли (1963) считал, что микориза у злаковых и бобовых растений относится к фикомицетному типу. Выделенные нами дополнительно для проверки его утверждения чистые культуры эндофитов из люцерны, гороха, вики, акации и бобов всегда имели многоклеточный мицелий, как и эндофиты из ржи, овса, тимофеевки, ежи, пырея и кукурузы. Многие исследователи, применив электронный микроскоп, подтвердили многоклеточную природу эндофитов.

Из всего изложенного следует, что обычно принятое и уже ставшее трафаретным положение о наличии у растений «везикулярно–арбускулярной фикомицетной микоризы» не соответствует действительности и не может быть признано научно доказанным.

Многоклеточное строение гиф эндофитов не дает основания причислить их к роду Rhizoctonia, от которых они отличаются как по морфологическим, так и по физиологическим свойствам. Сравнивая мицелий эндофитов с Rhizoctonia solani u R. ailcrholdii, выращенных в одинаковых по составу питательных средах, можно установить, что последние не образуют везикулярных вздутий, не имеют гранулированной плазмы, как эндофиты, и не синтезируют пигменты. Кроме того, обе культуры Rhizoctonia не обладают азотфиксирующей способностью и не синтезируют гормональных веществ. Все указанные различия заставляют отказаться от причисления эндофитов к указанному роду.