Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 17. Септиронанные гифы из пыльцы томатов

Участие симбионтных грибов в процессе оплодотворения растений может быть изучено под микроскопом. Нанесению пыльцы на рыльце и окраске их анилин–бляу должна предшествовать предварительная мацерация препарата в щелочи, что дает возможность отчетливо различать белок грибного происхождения по фиолетовой окраске и белок растительных клеток, окрашенных в голубой цвет.

Какие наблюдения цитологов подтверждают установленный нами факт наличия эндофитов в пыльцевой клетке?

При установлении двойного процесса оплодотворения яйца и вторичных клеток С. Г. Навашин (1951) отмечал проникновение спермия не только в зародышевый мешок, но и в окружающие его клетки нуцеллюса. Это явление было изучено и подтверждено Я. Е. Элленгорном и В. В. Светозаровой (1950), которые обнаружили, что полиспермия сопровождается подкисленном среды. Развитие легко распадающегося грибного мицелия при прорастании пыльны может объяснить явление полиспермии и также вызванное ростом гриба подкисление среды. В. Е. Козлов (1951), описывая цитологический процесс полиспермии у гороха, сообщает, что спермин при соприкосновении с яйцеклеткой разрыхляется и превращается в скопление множества гранул, в конце концов принимая вид длинных неправильных бусовидных нитей. В статье «Новый пример халацогамии» С. Г. Навашин (1951, С, 174) пишет: «Пыльцевые трубки грецкого ореха обладают способностью посылать боковые выросты, появляющиеся почти в любой точке пути пыльцевой трубки», В его груде представлены рисунки сильноветвящихся пыльцевых трубок в халаце. Сейчас, когда установлена способность пыльцевой клетки прорастать мицелием эндофитов, высказывание С. Г. Навашина служит подтверждением указанного процесса.

Как обычно, при изучении природных явлений новые наблюдения порождают новые исследования. Вот и в данном случае предстоит изучить, в чем заключается участие эндофитов в процессе оплодотворения? Служат ли их гифы транспортирующим средством для передвижения спермия в зародышевый мешок или они обеспечивают условия, благопрнятные для слияния двух разнополых клеток, а возможно, они гарантируют наследственную передачу грибных симбионтов растений однородного происхождения? Настоящий опыт показывает, как может гриб попасть в семена.

Нельзя не вспомнить раннюю работу Дж. Пекло (Peklo, 1913), который приложил много усилий, чтобы доказать наличие в семенах гиф грибов. Ему удалось слетать несколько снимков гиф в недозрелом зерне пшеницы. Он считал, что его богатый азотом алейроновый слой состоит из мицелия эндофитов, находящихся в состоянии анабиоза.

Мы разработали следующие приемы для получения чистых культур эндофитов из семян растений. После стерилизации поверхности семян их обрабатывали гормональным препаратом и помещали в стерильные чашки Петри для проращивания до образования первых корешков, после чего семена слегка растирали в стерильной агатовой ступке и переносили в питательную среду. Через несколько дней эндофиты начинают прорастать и скорость этого процесса зависит от степени микотрофности изучаемого семени.

В природных условиях гормональное воздействие на прорастающее семя оказывают эпифитные н ризосферные бактерии, которые обильно развиваются на прорастающем семени. Наиболее подробно эти бактерии были изучены Ю. М. Возняковской (1964), которая установила их способность синтезировать стимулирующие вещества, проникающие в ткани растении. Латвийский микробиолог Л. Л. Клинцаре (1970) создал из эпифитных бактерий препарат, стимулирующий рост растений, и получил на него в 1970 г. авторское свидетельство. При постановке стерильных опытов стерилизация семян лишает их гормонального воздействия указанных бактерий, в результате чего эндофиты из семян не переходят в корень.

Таким образом, метод выделения чистых культур симбионтных грибов способствовал выяснению сложного вопроса о распространенности эндофитов в надземной части растений. Его использование позволило установить наличие таких грибов во всех органах, включая пыльцу и семена. По вызывает сомнений, что синтетическая деятельность эндофитов сосредоточена в корнях, даже в тех случаях, когда нельзя визуально установить их наличие.

Наши четырехлетние исследования по выделению эндофитов из листьев, хвои, завязей, пыльцы и семян растений дают возможность установить, что источником грибной инфекции для корней и надземных органов растений служит прорастающее семя. Такая передача от семени к семени обеспечивает наследственную природу грибного симбиоза, а в ослабленном виде — и при вегетативном размножении от клубня к клубню, от луковицы к луковице и от черенка к саженцу. Для получения микотрофного растения в стерильных условиях нужно обработать семена гормональным препаратом растительного или микробного происхождения.

В природных условиях процесс образования эндотрофной микоризы происходит при активном участии симбионтных бактерий, когда в процессе прорастания семени значительно увеличивается количество эпифитных бактерий и их переход на поверхность молодых корней, где эти микроорганизмы рассматривают в качестве ризосферных бактерий. Продуцируемые ими биологически активные вещества активизируют выход симбионтных грибов, находящихся в алейроновом слое семени, и активное их прорастание в корни. При изучении нами первых корешков длиной 0,5 см в прорастающем семени можно было установить, что их поверхность покрыта слоем ризосферных бактерий. Стерилизация семян исключает возможность развития на них бактерий и тем самым продуцирование гормональных веществ, необходимых для прорастания эндофитов. Нанесение на стерильное семя гормональных препаратов обеспечивает развитие в корнях везикулярно–арбускулярной микоризы. Присвоение последней названия «фикомицетной» нужно еще суметь доказать тем исследователям, которые не хотят признать многоклеточную природу мицелия эндофитов (Гельцер, Кузнецова, 1977).

Вряд ли нужно увеличивать количество литературных примеров, чтобы прийти к выводу, что все значение производимых многочисленными авторами «заражений» стерильных семян различными грибами определятся добавлением некоторого количества гормональных веществ микробного происхождения, необходимых для активизации прорастания свойственных данному растению эндофитов из семян, клубней и луковиц, Вспомним, что выделение чистых культур эндофитов из любых частей растений стало возможным только после того, как была доказана необходимость наличия в питательных средах гормональных веществ. Как мы увидим дальше, эту зависимость симбионтных грибов от гормональных воздействий можно использовать для повышения их активности в корнях сельскохозяйственных культур.

Занимаясь изучением проблем происхождения эндофитов, мы не применяли «заражений» различными грибами, так как всегда считали эндофиты облигатными симбионтами, имеющими большое генетическое значение в сохранении вида растений. Нас интересовал вопрос о специфичности действия различных ростовых веществ на пробуждение эндофитов при прорастании семени, а также характер их действия: стимулируют ли они активность гриба или изменяют растение, создавая более благоприятные условия для развития грибов в корнях. Хотя наши опыты не сопровождались химическим изучением состава примененных ростовых веществ, они в качестве первой разведки могут представлять интерес, в особенности для решения второго вопроса.

В стерильных краткосрочных опытах по выяснению влияния различных стимулирующих веществ на развитие эндофитов из семени использовались следующие питательные среды: песок, почвенно–песчаная смесь, почвенные вытяжки с агаром при добавлении питательной среды Гельригеля. Этими средами заполнялись стаканы емкостью 200 мл, которые стерилизовались в автоклаве в зависимости от состава среды от 0,5 до 1 часа при 1 ат (0,1 МПа). Так как никто не указывал на возможное заражение эндофитами из воздуха, то в дальнейшем растения находились в обычных условиях и только иногда поверхность стаканов 'прикрывали парафинированным песком.

Семена стерилизовались сулемой или перекисью водорода, но так как в контрольных вариантах эндофиты не развивались, мы в дальнейшем ограничивались промывкой их спиртом и стерильной водой.

В качестве гормональных препаратов были взяты спиртовые вытяжки из различных гименомицетов, таких, как белые грибы (Boletus edulis), мухоморы (В. scaber), скрипица (Lactarius vellereus), различные сыроежки (Russula), фитобактериомицин (ФБМ), изготовляемый из актиномицета (Actinomyces lavendulae), гиббереллин, а впоследствии и наш препарат Симбионт 1, продуцентом которого был эндофит, выделенный из корней женьшеня. Семена контрольных растений замачивались в стерильной воде, а опытных — с добавлением в нее 2-3 капель указанных выше ростовых веществ. После 2-4 недель роста растений в стаканах при хорошей освещенности, их корни отмывались от среды, мацерировались в щелочи и продольные препараты изучались под микроскопом при окраске анилин–бляу.

В отличие от поперечных срезов корней, обычно применяемых при изучении микотрофностн, продольные препараты дают возможность просмотреть содержание эндофитов в больших отрезках корня. В зависимости от количества полей зрения, в которых наблюдаются гифы эндофитов, арбускулы, спорангиолы и везикулы, а главное по форме и размерам последних дается оценка микотрофности растений по 5-балльной системе.

Хорошим объектом для изучения влияния ростовых веществ на однолетних растениях были сильно микотрофные просо сорта Саратовское 853 и пшеница сорта Сарубра. После намачивания контрольных семян 30 мин в воде, а опытных — с добавлением 2 капель спиртовых вытяжек из указанных гименомицетов и препаратов ФБМ, гиббереллина, их высушивали и высеивали. Через месяц роста растений на стерильных агаризованных почвенных вытяжках корни в опытных вариантах, кроме варианта с гиббереллином, значительно превосходили по размерам контрольные. Если это основное и самое характерное действие ростовых веществ не проявляется при хороших условиях роста растений, даже если отмечено небольшое улучшение развития эндофитов в корнях, то у изучаемого препарата явно отсутствует способность к гормональному воздействию. В контроле эндофиты не были визуально обнаружены под микроскопом, а в опытных вариантах у проса имелись характерные для него клубки септированных гиф и крупные круглые везикулы с оценкой в 3-4 балла. Подобные результаты получены и при изучении корней менее микотрофной культуры пшеницы.

Вторая серия опытов, проведенная с пшеницей сорта Сарубра, отличалась тем, что в них семена не обрабатывали вытяжками гименомицетов и препаратов, а последние вносили в стерильную среду. Результаты предыдущих опытов повторились, и микотрофность корней была установлена во всех опытных вариантах, но целесообразность использования такого приема для нестерильных почв должна быть проверена, так как в связи с их возможной минерализацией активность препаратов может снижаться.

Наши опыты с применением указанных гормональных воздействий для развития эндофитов в корнях в тех случаях, когда единственным источником их образования были поверхностно стерильные семена, подтвердили мнение исследователей о наследственной передаче грибного симбиоза в растениях. Окончательное признание «циклической наследственности» было связано с доказательством наличия эндофитов в надземных частях растений. Применение методов выделения чистых культур симбионтных грибов из листьев, хвои, завязей, пыльцы, семян и тканевых культур, выращенных из одной клетки в стерильных условиях вне организма, позволило установить присутствие эндофитов в надземных частях растений, чего нельзя было убедительно доказать с помощью визуального их изучения под микроскопом.

Рассмотрение вопроса о наследственной передаче грибного симбионта растений мы хотим закончить результатами изучения эндофитов у вегетативно размножаемых культур (черенками, усами) и у живородящих растений. Что касается картофеля, размножаемого в основном клубнями, то о нем подробнее будет сказано в других главах, так как наиболее важные выводы о значении микотрофизма были получены при изучении именно этой культуры.

Образующиеся миниатюрные зародыши на концах листьев живородящих растений Bryophyllum degramonlianum представляют собой интересный объект для изучения миграции симбионтных грибов в надземной части растений. Снятые с листьев материнского растения ростки имели 3-5 листочков и несколько тонких корешков. После промывания стерильной водой их помещали в закрытые ватными пробками стерильные, склянки с песком, смоченным питательным раствором с уменьшенным содержанием азота. Опыт включал контроль и 2 опытных варианта: с добавлением в среду 0,5 мл гиббереллина и с прибавкой 0,5 мл спиртовой вытяжки из гриба скрипицы. При обработке гиббереллином бриофиллум сильно, вытянулся, что характерно для действия этого препарата. Вытяжка из скрипицы способствовала лучшему развитию корней и листьев, чем в контроле. Через 40 дней при тщательном изучении корней у контрольных растений гифы грибов не были визуально обнаружены. В варианте с гиббереллином наблюдались большое количество типичных везикул и гифы эндофитов с оценкой в 2 балла. Наиболее сильная микотрофность корней была установлена у растений, обработанных метаболитами гименомицета. Здесь в большом количестве встречались многоклеточные гифы и скопления круглых везикул, ярко окрашенных анилин–бляу в фиолетовый цвет, с оценкой в 5 баллов. В данном опыте мы установили (передачу симбионтного гриба через стебель и листья материнского растения своему вегетативному потомству.

При образовании корней у веток ивы и тополя, помещенных в воду, в которую добавлялись питательные соли, визуально наблюдаемые эндофиты появились в короткий срок только в тех вариантах, где в среду вносили несколько капель метаболитов из гриба мухомора или подберезовика.

Такие же опыты были поставлены с семенами лука, укропа и клевера. Во всех случаях ростовые вещества из гименомицетов обеспечивали развитие эндофитов из семян растений, выращиваемых в стерильной среде, тогда как в контрольных вариантах эндофиты в корнях не развивались.

Приведенные результаты опытов, количество которых можно было бы значительно увеличить, не позволяют сомневаться в наследственной передаче эндофитов через прорастающее семя или вегетативные органы растений при непременном наличии в среде гормональных веществ растительного или микробного происхождения. Неясным, однако, оставался вопрос о сущности действия ростовых веществ: оказывают ли они влияние непосредственно на грибной симбионт или, создавая тонкую корневую систему растения, способствуют тем самым развитию в ней симбионта? Для ответа на него нужно было установить влияние гормональных препаратов на развитие растений в различных стерильных средах.

Обычно исследователей не удовлетворяют среды, в которых приходится ставить стерильные опыты. Дело в том, что для этой цели нельзя использовать почву, в которой в процессе стерилизации накапливаются токсические для роста растений вещества. Замена почвы водой с добавлением нужных питательных солей приводит к значительному изменению всего облика корневой системы, которая в водной культуре состоит из толстых слаборазветвленных стержневых корней при полном отсутствии корешков третьего порядка, т. е. тех, где хорошо себя чувствуют эндофиты (рис. 18). Несколько лучше развиваются корневые системы в песчаных средах, но и в них растения (потребляют питательные вещества из водного раствора, что не способствует образованию мельчайшей корневой системы, которая развивается в том случае, когда элементы питания находятся в поглощенном состоянии. Микробиологи часто применяют в качестве стерильной среды жидкое стекло или агаровые среды, которые представляют собой плохо аэрируемую плотную коллоидную массу, куда корни растений проникают с трудом.

Рис. 18. Корни кукурузы, выращенной в различных средах: в водной культуре (1), песке (2), силнкагеле (3), в почве (4)

Плохие свойства указанных питательных сред заставляли исследователей применять для стерильных культур смешанные среды, в которых почва в 2-3 раза разбавлялась песком, что несколько улучшало физические свойства среды и уменьшало концентрацию токсических веществ почвы после ее стерилизации.

В поисках наиболее пригодных для наших опытов стерильных сред был испытан заводской гранулированный силикагель марки ШСК (шихта силикагель крупнопористый). Хорошие физические условия среды определяются структурой силикагеля, а его высокая поглотительная способность имитирует поглощающий комплекс почвы. Стерилизация силикагеля не меняет его свойств.