Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Исследования были сконцентрированы на идентификации особенностей Х-хромосомы, участвующей в рекрутировании DCC. Интересно отметить, что у млекопитающих и плодовой мушки эквивалент DCC «нацеливается» на Х-хромосому комбинацией Х-специфичных не кодирующих РНК и элементов нуклеотидной последовательности Х-хромосомы (см. главы 16 и 17). На сегодняшний день нет данных о том, что некодирующие РНК играют какую-нибудь роль в компенсации дозы у С. elegans. Изящный подход был использован для исследования вопроса о том, рекрутируется ли DCC червей независимо ко многим сайтам или же только к одному или немногим сайтам, после чего комплексы распространяются в примыкающие хромосомные районы (Csankovszki et al., 2004; Meyer, 2005). Черви из штаммов, содержащих дупликации различных участков Х-хромосомы, были окрашены на компоненты DCC. Согласно предложенной интерпретации, ассоциация DCC с дупликацией означает, что дупликация и соответствующий район интактной Х-хромосомы содержат сайт рекрутирования DCC. Отсутствие ассоциации DCC с дупликацией, но связь DCC с соответствующим участком интактной Х-хромосомы, согласно этой трактовке, означают, что участок, включенный в Х-дупликацию, не имеет сайта рекрутирования DCC и, вместо этого, приобретает DCC за счет распространения из соседних районов. Эти эксперименты позволили идентифицировать по крайней мере 13 участков, которые могут независимо рекрутировать DCC, и доказали, что DCC распространяется по Х-хромосоме (рис. 15.5) (Csankovszki et al., 2004).

Рис. 15.5. Опосредованная DCC даун-регуляция Х-хромосом и локуса her-1

^{В соматических тканях гермафродита DCC уменьшает экспрессию X наполовину и подавляет экспрессию her-1 в 20 раз. DCC собирается у животных XX. Он рекрутируется к узнаю­щим элементам и распространяется по обеим Х-хромосомам, уменьшая экспрессию многочисленных сцепленных с X генов вдвое. Он также связывается с участком аутосомного гена her-1, находящимся «вверх по течению», и уменьшает экспрессию в 20 раз (обозначается DCCH, чтобы показать, что комплекс, связывающийся с her-1, не имеет белка DPY-21) (видоизменено, с любезного разрешения авторов, из Alekseyenko and Kuroda, 2004; иллюстрация Kathenne Sutliff[©AAAS])}

Некоторые из этих участков рекрутируют в сильной степени, другие — в слабой, заставляя предполагать либо присутствие варьирующего числа сайтов рекрутирования, либо присутствие сайтов с варьирующей способностью рекрутировать и (или) стимулировать распространение вдоль Х-хромосомы. Тестирование все более мелких участков сузило сайт рекрутирования DCC одного участка до 33 п.о. (Меуег, 2005). Эта последовательность длиной 33 п.о. является уникальной в геноме. Определение других минимальных сайтов рекрутирования — дело первостепенной важности. Другая важнейшая задача — выяснить, каким образом происходит распространение DCC из первоначальных сайтов рекрутирования. Распространение может быть опосредовано кооперативными взаимодействиями между DCCs или же локальными видоизменениями хроматина в структуру, облегчающую связывание все бОлыиих количеств DCC в петле с положительной обратной связью, как это было показано для распространения гетерохроматина у Schizosaccharomyces pombe (глава 8).

5. Эффекты DCC: даун-регуляция сцепленных с X генов и аутосомного гена her-1

Регулирование структуры хроматина для достижения скромного двукратного изменения экспрессии сцепленных с X генов, как это происходит у червей и плодовых мушек, представляется, с механистической точки зрения, весьма интересным. У плодовых мушек модуляция экспрессии генов связана с определенными модификациями гистонов и с утратой линкерного гистона из Х-хромосомы (см. Главу 16). В соматических клетках червей-гермафродитов не было отмечено никаких явных различий ни в уровне, ни в спектре модификаций гистонов на двух Х-хромосомах с компенсацией дозы по сравнению с аутосомами. Млекопитающие, плодовые мушки и черви, по-видимому, приспособили разные предсуществовавшие системы для специализированной роли модуляторов экспрессии генов на Х-хромосоме. Млекопитающие адаптировали основанный на гетерохроматине сайленсинг для инактивации одной из двух Х-хромосом у ХХ-пола. Плодовые мушки приспособили модифицирующую хроматин машинерию для изменения состояния единственной Х-хромосомы у животных XY, что приводит к ап-регуляции экспрессии генов. С. elegans адаптировали механизм конденсации хромосом, используемый в митозе и мейозе, для даун-регуляции обеих Х-хромосом у ХХ-пола. Важнейшими вопросами являются механизм даун-регуляции у червей и то. каким образом она ограничена двукратными изменениями.

При сходстве DCC и 13S комплекса конденсина вероятный механизм даун-регуляции экспрессии генов заключается в опосредованной DCC конденсации хроматина. Это может ограничивать доступ РНК полимеразы и (или) транскрипционных факторов к промоторным районам, мешать продвижению РНК-полимеразы через транскрипционные единицы и (или) замедлять реинициацию транскрипции в каждом гене. Ключи к механизму репрессии могут оказаться в единственном аутосомном локусе her-1, который является единственной известной аутосомной мишенью DCC и который демонстрирует более экстремальную, 20-кратную даун-регуляцию экспрессии генов, опосредованную DCC (рис. 15.6) (Dawes etal., 1999; Chuetal., 2002). Репрессия her-1 стимулирует половое развитие по гермафродитному типу (рис. 15.4). Следовательно, DCC способен достигать в 10 раз большей репрессии в her-1, чем он достигает на Х-хромосомах. Одним известным различием между DCC, связанным с Х-хромосомами, и комплексом, связанным с her-1, является DPY-21. DPY-21 присутствует на Х-хромосомах, но не в локусе her-1 (Yonker and Меуег, 2003).

135-комплекс конденсина нужен для регулирования структуры хромосом в масштабах всего генома, чтобы облегчить сегрегацию хромосом. Адаптация и модификация комплекса конденсина для формирования ВВС делают его эффекты более тонкими и сужают его регуляцию до (преимущественно) одной хромосомы. DCC с DPY-21 слабо репрессирует транскрипцию многих генов на Х-хромосоме, тогда как DCC без DPY-21 каким-то образом сильно подавляет транскрипцию в локусе her-1. В будущем было бы крайне интересно проанализировать, каким образом разные комплексы конденсин/ DCC осуществляют свои различающиеся функции.

6. Регулирование Х-хромосом в зародышевом пути

У С. elegans для регулирования экспрессии с Х-хромосом в зародышевом пути используются другие стратегии, чем в соматических тканях, поскольку соматический способ регуляции Х-хромосом (т.е. с помощью DCC) не действует в зародышевых клетках. Некоторые существенные компоненты соматического DCC не экспрессируются в зародышевой линии (например, SDC-2); другие же экспрессируются в зародышевых клетках, но обнаруживаются на всех хромосомах (например, MIX-1, DPY-26 и DPY-28). У С. elegans MIX-1, как упоминалось выше, является компонентом и DCC, и канонического комплекса конденсина. Согласно современным взглядам, конденсиноподобный комплекс был приспособлен к тому, чтобы играть специализированную специфичную для Х-хромосомы роль, но эта роль, по-видимому, осуществлялась лишь в соматических тканях. В зародышевом пути те белки DCC, которые экспрессируются, заняты, вероятно, на более общих ролях в митотической и мейотической организации и сегрегации хромосом.

Отсутствие членов DCC в зародышевой линии ставит вопрос о том, действует ли в этой ткани какой-нибудь способ компенсации дозы. Напомним, что функция компенсации дозы заключается в том, чтобы достичь эквивалентной экспрессии сцепленных с X генов у обоих полов и обеспечить тем самым жизнеспособность и нормальное развитие. Современные данные позволяют предположить, что, в противоположность двукратной даун-регуляции обеих Х-хромосом в соматических клетках XX, Х-хромосомы глобально сайленсируются на большинстве стадий развития зародышевой линии как у животных XX, так и у животных ХО (рис. 15.6). Отсутствие транскрипции с Х-хромосом в зародышевых клетках обоих полов, казалось бы, делает не нужной пол-специфическую регуляцию этой хромосомы. Тем не менее, существуют специфические механизмы, регулирующие Х-хромосомы в зародышевых клетках и, как подозревают, эти механизмы мало похожи по форме и функциям на соматические механизмы, уже описанные в этой главе.

7. Развитие зародышевого пути и сайленсинг Х-хромосомы

У С. elegans взрослые гонады обоих полов содержат упорядоченный ряд последовательных стадий развития зародышевых клеток. Зародышевые клетки пролиферируют в дистальном участке, вступают в мейоз в средней части и завершают гаметогенез в проксимальном районе (рис. 15.1 и 15.7) (обзор см.: Schedl, 1997). У самцов ХО эта прогрессия имеет место в единственном тубулярном семеннике, который постоянно производит сперму. У гермафродитов XX два тубулярных плеча гонады вначале, на поздней личиночной стадии, производят сперму, а затем, во взрослом состоянии, переключаются на производство оопитов. Зрелые ооциты выталкиваются в сперматеки и оплодотворяются спермой, находясь здесь до последующей экструзии в матку. Таким образом, производство некоторого количества спермы червями XX делает возможным гермафродитный способ размножения взрослой особи. Однако яичник и некоторые другие соматические ткани у взрослых животных XX могут считаться по существу женскими по своей идентичности и функции.

Х-хромосомы в зародышевой линии сайленсируются и у гермафродитов XX. и у самцов ХО. Этот сайленсинг характеризуется такими репрессивными гистоновыми метками, как метилирование H3K27; Х-хромосомы в зародышевых клетках гермафродита особенно обогащены H3K27me3 (Bender et al., 2004). Имеет место также отсутствие ацетилирования гистонов, обычно связанное с активным хроматином, и метилирование H3K4, которое, как показывает иммунофлуоресцентный анализ (рис. 15.7), коррелирует с активно транскрибируемыми районами (Kelly et al., 2002). Сайленсинг Х-хромосомы в зародышевой линии С. elegans достигается преимущественно с помощью двух механизмов, обсуждаемых ниже (рис. 15.6). Первый работает посредством мейотического сайленсинга неспаренной ДНК (MSUD), который включает единственную Х-хромосому у животных ХО. Второй механизм работает посредством модификаций гистонов, опосредованных белками MES; этот механизм сайленсинга наиболее интенсивно изучался у животных XX, но, вероятно, действует и у животных ХО. У ранних эмбрионов сайленсинг отцовской Х-хромосомы сохраняется на протяжении нескольких клеточных циклов после оплодотворения и обозначается как сайленсинг импринтированной Х-хромосомы (imprinted X silencing) (рис. 15.6).

Рис. 15.6. Регуляция Х-хромосом в жизненном цикле гермафродита XX

^{Этот рисунок иллюстрирует, что Х-хромосомы регулируются разными механизмами на разных стадиях и в разных тканях: инактивация импринтированной X (I) отцовской Х-хромосомы у раннего эмбриона, компенсация дозы (DC) в соматических тканях эмбрионов и червей 30-клеточной и более поздних стадий и опосредованный MES сайленсинг в зародышевом пути. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК (MSUD) также происходит в зародышевой линии; это сайленсирует единственную Х-хромосому у самцов ХО}

8. Единственная Х-хромосома у самцов обнаруживает метки гетерохроматина

Самое раннее предположение, что в зародышевой линии Х-хромосома отличается от аутосом, вытекает из цитологических наблюдений. Единственная Х-хромосома у червей-самцов приобретает характерную структуру во время пахитены в мейотической профазе — она гиперконденсируется, формируя шаровидную структуру, напоминающую «половое тельце» XY, видимое во время мужского мейоза у млекопитающих (Goldstein and Slaton, 1982; Handel, 2004). Аутосомы конденсируются позже в мейотической профазе, близко к началу сперматогенеза. Преждевременная конденсация Х-хромосомы также видна во время мужского мейоза у гермафродитов XX и у сексуально трансформированных самцов XX; это позволяет предполагать, что преждевременная конденсация Х-хромосомы происходит в ответ на пол зародышевой клетки, а не на статус плоидности или спаренности Х-хромосомы. Соответственно, у гермафродитов XX зародышевые клетки, предназначенные для оогенеза, не обнаруживают преждевременной конденсации Х-хромосомы.

В дополнение к преждевременной конденсации единственная Х-хромосома у самцов ХО временно аккумулирует заметные количества H3K9me2, которые появляются во время пахитены и исчезают в диплотене (рис. 15.7) (Kelly et al., 2002). Это обогащение H3K9me2 не происходит в ходе сперматогенеза XX, как у гермафродитов, так и у трансформированных самцов XX. Однако обогащение Х-хромосомы H3K9me2 наблюдается в оогониях, проходящих стадию пахитены у трансформированных по полу гермафродитов ХО, причем динамика этого процесса сходна с таковой у самцов ХО (Bean et al., 2004). Специфичное приобретение метки гетерохроматина на Х-хромосоме в мейозе ХО оказывается, таким образом, следствием ее неспаренного статуса, а не пола данной зародышевой линии, через которую она проходит. «Нацеливание» H3K9me2 на неспаренную ДНК не ограничивается нуклеотидными последовательностями Х-хромосомы; оно обнаруживается также на неспаренных аутосомных фрагментах и транслокациях (Bean et al., 2004).

Такая «нацеливаемая» репрессия неспаренной ДНК в мейозе имеет место не только у С. elegans. Подобное распознавание и репрессия неспаренной ДНК происходят во время мейоза и у других организмов, в том числе у Neurospora и мыши. Это явление обозначается как MSUD (meiotic silencing of unpaired DNA — мейотический сайленсинг неспаренной ДНК) (Shiu et al., 2001; Baarends et al., 2005; Turner, 2005; Turner et al., 2005). У мышей, например, «половое тельце» XY со слабым синапсом во время мужского мейоза аналогичным образом обогащено H3K9me2, и это является следствием его неспаренного состояния (Cowell et al., 2002; Turner et al., 2005). Мейотический сайленсинг у Neurospora требует активности белков с консервативными ролями в РНК-интерференции (RNAi). В их число входят РНК-направляемая РНК-полимераза (RdRP), белок, родственный белку Argonaute (консервативный компонент инуцируемых РНК сайленсирующих комплексов, RISCs) и нуклеаза Dicer (обзор см. Nakayashiki, 2005; см. главу 8). У С. elegans обогащение H3K9me2 на неспаренной ДНК нуждается в EGO-1, RdRP, которая ограничена зародышевой линией, но не требует Dicer (Maine et al., 2005). Это заставляет предполагать, что в то время как имеет место консерватизм мейотического сайленсинга (репрессии неспаренной ДНК), механизм, с помощью которого это достигается, мог по-разному развиваться у разных организмов.

^{Рис. 15.7. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом во время развития зародышевых клеток}

^{У обоих полов зародышевые клетки проходят митоз (слева), вступают в мейоз в переходной зоне и проходят профазу мейоза I. У обоих полов клетки, предназначенные для формирования спермы, завершают мейотические деления в гонаде. У гермафродитов клетки, предназначенные для формирования ооцитов, проходят через мейотическую профазу в гонаде и завершают мейотические деления после овуляции и оплодотворения. Присутствие разнообразных модификаций гистонов на Х-хромосоме (Х-хромосомах) в зародышевых клетках показано красными (для репрессивных модификаций) и зелеными (для активирующих модификаций) полосками. Как показано на врезках справа, антитела к конкретным модификациям гистонов показывают, что Х-хромосомы в зародышевых ядрах маркируются иначе, чем аутосомы, и сайленсированы. H3K4me2 (зеленый цвет), метка активно экспрессируемого хроматина, отсутствует в Х-хромосомах пахитенных ядер XX. H3K9me2 (зеленый цвет), метка гетерохроматина, сконцентрирован на Х-хромосоме в пахитенных ядрах ХО. ДНК окрашивается красным цветом. Стрелки указывают репрезентативные Х-хромосомы на каждом изображении}

В противоположность тому, что происходит в мейозе самцов ХО, Х-хромосомы либо в сперматогониях XX, либо в оогониях XX не накапливают H3K9me2 в сколько-нибудь заметных количествах. Это различие обусловлено, вероятно, полным синапсисом Х-хромосом в мейозе гермафродитов. Почему сайленсинг неспаренных ДНК обычно оказывается консервативной чертой полового воспроизведения? У многих организмов спаривание гомологов ограничено исключительно мейозом, и во время синапсиса новые вставки, уникальные для одного из гомологов, экспонировались бы как участки неспаренной ДНК. Предположили, что распознавание и сайленсинг неспаренных последовательностей во время мейоза обеспечивают механизм для самосканирования (self-scanning) диплоидного генома и могли бы обеспечить защиту против инвазии (или экспансии) перемещаемых элементов. Как еще одно следствие, следует отметить, что гены, экспрессируемые во время мейоза, сталкивались бы с сильным отбором против нахождения их на неспаренной хромосоме (такой, как Х-хромосома самца). Такой отбор приводил бы к формированию уникального генетического профиля Х-хромосомы, наблюдаемого у С. elegans. Интересно пофантазировать на тему о том, что геномная война между транспозонами и их хозяевами и эпигенетические механизмы, развившиеся как оружие в этой битве, сформировали геномы и привели к генетической изменчивости. Эта генетическая изменчивость, в свою очередь, могла создать дефекты спаривания, достаточные для включения мейотического сайленсинга существенных локусов и, отсюда, мейотической несовместимости. Таким путем эпигенетический сайленсинг во время мейоза теоретически мог внести свой вклад в репродуктивную изоляцию и видообразование.

9. Влияние MSUD на паттерны экспрессии генов в зародышевом пути

Исследования транскрипции в зародышевой линии в масштабах экспрессии всего генома показали, что имеется замечательная разница в профилях накопления иРНК с генов, картирующихся на Х-хромосоме, по сравнению с генами аутосом (Reinke et al., 2000, 2004). Гены, необходимые для сперматогенеза, а также общие, или «внутренние» («intrinsic») гены, экспрессируемые в зародышевой линии, явно «недопредставлены» в Х-хромосоме. Гены с увеличенной экспрессией в зародышевых линиях оогенеза также «недопредставлены» в Х-хромосоме, но не до такой степени, как гены сперматогенеза или «внутренние» гены зародышевой линии. Другими словами, гены, которые необходимы для жизнеспособности и функционирования зародышевых клеток, по большей части в Х-хромосоме отсутствуют. Действительно, большинство генов, связанных с оогенезом и находящихся в Х-хромосоме, демонстрируют экспрессию на поздних стадиях мейоза, что коррелирует с активацией Х-хромосомы (рис. 15.6и15.7).0 поздней мейотической активации свидетельствует накопление «активирующих» модификаций гистонов к концу пахитены, в том числе ацетилирование H3 и Н4 и метилирование H3K4Ю до уровней, сравнимых с уровнями, которые наблюдаются в аутосомах (Kelly et al., 2002). Это позволяет предполагать, что тенденция к тому, чтобы гены не локализовались в Х-хромосоме, наиболее выражена для тех из них, которые функционируют на ранних стадиях развития зародышевых клеток, общих для обоих полов. Кроме того, идентифицировали ряд дупликаций генов с паралогами Х/аутосома, в которых аутосомная копия однозначно требовалась для функционирования зародышевых клеток. В этих примерах сцепленная с X копия функционирует в соматических линиях, но не требуется в зародышевых клетках, в которых активна аутосомная копия (Maciejowski et al., 2005). В совокупности вышеописанные данные позволяют предполагать, что Х-хромосома является недружелюбной средой для генов с функциями, существенными для ранних зародышевых клеток у обоих полов. Гены, которые требуются лишь во время позднего оогенеза (т.е. требующиеся только в женских зародышевых клетках поздних стадий; рис. 15.2), были бы иммунными к давлению отбора, вызываемому асинапсисом в мужских зародышевых клетках, и таким образом их сцепление с X было бы возможным.

Гены С. elegans с функциями, существенными для ранних стадий зародышевой линии, очевидно были исключены из Х-хромосомы. были утеряны из Х-хромосомы или подверглись дупликации, после чего зародышевая линия зависела уже от аутосомной копии. Последнее предполагает возможный путь для эволюции уникального генетического профиля Х-хромосомы. Аналогичные силы, по-видимому, действуют на сцепленные с X гены и у других видов, в том числе у плодовой мушки и у млекопитающих (Wu and Xu, 2003). Однако в настоящее время мы не понимаем механизмы, удаляющие гены зародышевой линии из Х-хромосомы.

10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модификаторами гистонов MES