Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

В предыдущем разделе описывалась репрессия посредством формирования гетерохроматина, специфичная для единственной Х-хромосомы у самцов ХО и ограниченная стадией пахитены мейоза благодаря MSUD. Каким образом Х-хромосомы поддерживаются в репрессированном состоянии хроматина на протяжении других стадий развития зародышевой линии и у гермафродитов XX? Генетический скрининг мутантов со стерильностью, обусловленной материнским эффектом (mes — matemal-effect sterile), выявил группу из четырех генов mes, которые участвуют в сайленсинге Х-хромосомы у животных XX, а также, вероятно, и у животных ХО. Совместное применение генетического и молекулярного анализа показало, что кодируемые белки MES влияют на сайленсинг, регулируя часть спектра модификаций гистонов, обнаруживаемого на Х-хромосомах в зародышевых клетках. Их функции существенны для выживания и развития зародышевых клеток.

Три белка MES — MES-2, MES-3 и MES-6 — функционируют вместе в составе комплекса, похожего на Репрессивный Комплекс Polycomb (PRC2 у плодовой мушки и позвоночных (см. Xu et al., 2001; Bender et al., 2004; Keteletal., 2005; глава 11). MES-2 и MES-6 червей — это ортологи двух субъединиц PRC2, E(Z) (Enhancer of zeste) и ESC (Extra sex combs) (табл. 15.1). E(Z) и ESC, во взаимодействии по крайней мере с двумя другими партнерами, катализируют метилирование H3K27 гистона, которое, как упомянуто выше, является репрессивной модификацией гистонов. Аналогично этому, MES-2 и MES-6, в комплексе с новым белком MES-3, опосредуют метилирование H3K27 (рис. 15.8). Домен SET белка MES-2 ответствен за метилтрансферазную (НКМТ) активность в отношении лизинов гистонов, тогда как MES-6 и MES-3 оказываются необходимыми либо для связывания с субстратом, либо для усиления каталитической активности. MES-2, MES-3 и MES-6 ответственны за все выявляемое ди- и триметилирование по H3K27 (H3K27me2 и H3K27me3) в большинстве районов зародышевой линии и у ранних эмбрионов, но еще одна НКМТ катализирует это метилирование в соматических тканях. Важно отметить, что в пределах зародышевой линии содержание полностью репрессивной метки, H3K27me3, в Х-хромосомах повышено (рис. 15.8) (Bender et al., 2004). Одним из последствий уничтожения метилирования H3K27 в зародышевой линии является активация генов на Х-хромосоме; у мутантов mes-2, mes-З или mes-6 Х-хромосомы в зародышевой линии гермафродитов не имеют H3K27me, приобретают метки активного хроматина (например, H3K4me и Н4К12ас) и декорируются транскрипционно активной формой РНК-полимеразы (Fong et al., 2002; Bender et al., 2004). Эти данные позволяют предположить, что комплекс MES-2/3/6 участвует, возможно даже непосредственно, в сайленсинге Х-хромосом в зародышевой линии червей. Действительно, предполагается, что десайленсинг Х-хромосом является причиной дегенерации зародышевой линии, наблюдаемой у гермафродитов мутантов mes. Аналогично участию MES-2 и MES-6 в сайленсинге Х-хромосом зародышевой линии гомологи MES-2 и MES-6 у позвоночных участвуют в инактивации соматической Х-хромосомы у животных XX (главы 11 и 17).

Рис. 15.8. Модель, показывающая, каким образом MES-2/3/6 и MES-4 участвуют в сайленсинге Х-хромосомы в зародышевой линии

^{Комплекс MES-2/3/6 концентрирует метку репрессивного хроматина (H3K27me3) на Х-хромосомах и отталкивает MES-4 от Х-хромосом. MES-4 концентрирует другую метку хроматина (H3K36me2) на аутосомах и, как предполагается, отталкивает неизвестный репрессор (желтый шестиугольник), помогая тем самым сфокусировать действие этого репрессора на Х-хромосомах. Результатом оказывается сайленсинг Х-хромосом в результате совместного действия репрессора «желтый шестиугольник» и катализируемого MES-2/3/6 репрессивного метилирования гистонов}

Каким образом комплекс MES-2/3/6 «нацеливается» на участки ДНК, предназначенные для репрессирования, и как метилирование H3K27 подавляет экспрессию генов? Ответы на эти вопросы мы получаем на Drosophila (глава 11). У мух комплекс E(Z)/ESC рекрутируется связывающимся с ДНК белком РНО к определенным сайтам, называемым элементами ответа Polycomb (PREs — Polycomb Response Elements) (Wang et al., 2004). После того как этот комплекс локально метилирует H3K27, репрессия генов опосредуется, по крайней мере частично, рекрутированием репрессивного комплекса Polycomb 1 (PRC1) к H3K27me (Wang et al., 2004). Удивительно, что геном С. elegans не содержит явных гомологов pho или большинства генов, кодирующих PRC1. Поэтому «нацеливание» комплекса MES-2/3/6 и то, как он достигает репрессии, связано, вероятно, со стратегиями, отличающимися от тех, что используются у Drosophila.

Четвертым белком MES, участвующим в репрессии Х-хромосомы в зародышевой линии, является MES-4. Его распределение является нестандартным для связанных с хромосомой белков и полностью противоположно тому, что можно было бы ожидать. В противоположность другим белкам MES, MES-4 связывается с пятью аутосомами, в виде бэндов, и совершенно отсутствует на большей части длины Х-хромосомы (рис. 15.8) (Fong et al., 2004). MES-4, подобно MES-2, содержит домен SET и тоже обладает активностью НКМТ (Bender et al., 2006). Он отвечает за большую часть выявляемого диметилирования H3K36 (H3K36me2) в зародышевой линии и у ранних эмбрионов. Как позволяет предсказать связь MES-4 с аутосомами, H3K36me2 заметно концентрируется на аутосомах. В соматических тканях и у эмбрионов на поздних стадиях развития за метилирование H3K36 отвечает другая НКМТ. Эта последняя активность оказывается связанной с транскрипционной элонгацией, как и в случае дрожжей. Опосредованное MES-4 метилирование H3K36 на аутосомах не зависит от транскрипции и, вероятно, играет другую, нужную для зародышевой лини, эпигенетическую роль (Bender et al., 2006).

Ключевые нерешенные моменты определяют, каким образом MES-4 «нацеливается» на аутосомы и какую роль он там играет. Интересно, что исключение MES-4 из Х-хромосом требует MES-2, MES-3 и MES-6 (рис. 15.8); в отсутствие любого из этих белков MES MES-4 распространяется на X (Fong et al., 2002). Полагают, что нормальная концентрация MES-4 на аутосомах участвует в сайленсировании генов на X. Одна из моделей заключается в том, что MES-4 и (или) его метальная метка (H3R36me2) отталкивает глобальные репрессоры хроматина (желтые шестиугольники на рис. 15.8) с аутосом и таким образом фокусирует действие репрессоров на Х-хромосомах (Fong et al., 2002). Утрата MES-4 вытитровывала бы эти репрессоры с Х-хромосомы на аутосомные районы, и это приводило бы к десаиленсингу X. Комплекс MES-2/3/6 является логическим кандидатом на роль отталкиваемого MES-4 репрессора Однако распределение метилирования H3K27, катализируемого MES-2/3/6, не изменяется видимым образом у мутантов mes-4. Поэтому продолжаются поиски других репрессоров, которые могут принимать в этом участие. Эта модель действия MES-4 сходна с моделью «приобретения специфичности через предотвращение неоднородности» («gaining specificity by preventing promiscuity»), предложенной для Dot1 Saccharomyces cerevisiae (van Leeuwen and Gottschling, 2002). Полагают, что опосредованное Dot1 метилирование H3K79 по хромосомам отталкивает репрессоры Sir и помогает сфокусировать их действие на теломерах. Утрата Dot1 делает возможным распространение Sirs от теломер и приводит к десайленсингу теломер.

Фенотип mes представляет собой превосходный пример эпигенетического феномена с прямой связью с модификациями гистонов. Мутация, связанная с материнским эффектом, определяется как такая мутация, мутантный фенотип которой не выявляется у гомозиготных мутантов первого поколения, но зато обнаруживается у их потомства. В случае мутантов mes/mes первого поколения присутствие некоторых количеств продукта MES дикого типа, продуцируемых матерью mes/+ и упакованных в ооцит, достаточно для должной экспансии двух примордиальных клеток в более чем тысячу полностью функциональных зародышевых клеток. Однако зародышевые клетки у этих фертильных червей mes/mes не могут продуцировать функциональный продукт MES для своего потомства. В результате у этого потомства примордиальные зародышевые клетки претерпевают незначительную пролиферацию и дегенерируют. Активности НКМТ, кодируемые mes-2 и mes-4, должны устанавливать наследуемое состояние хроматина, которое соответствующим образом поддерживается в многочисленных потомках двух первоначальных примордиальных зародышевых клеток. Современная модель функционирования белка MES (рис. 15.8) сводится к тому, что MES-2, MES-3 и MES-6 действуют в комплексе и концентрируют репрессивную модификацию хроматина (H3K27me) на Х-хромосомах в зародышевой линии и непосредственно участвуют в сайленсинге Х-хромосомы. Их активность отталкивает также MES-4 от X. В результате MES-4 покрывает аутосомы H3K36me и модифицирует их — предполагается, что их активность отталкивает репрессивную активность и помогает сфокусировать ее на X. Полагают, что эта система MES действует эпигенетически в зародышевой линии матери и в ранних эмбрионах и устанавливает домены хроматина, которые должным образом маркированы для последующей экспрессии (аутосомные районы) или сайленсинга (Х-хромосомы) в ходе развития зародышевой линии у личинок (см. рис. 15.6). Утрата этой системы MES ведет к гибели зародышевой линии и стерильности, вероятно благодаря, по крайней мере отчасти, десайленсингу Х-хромосом.

11. Х-хромосома спермия импринтирована

Геномы, привнесенные разными гаметами, поступают в зиготу с весьма различными эпигенетическими историями (рис. 15.6). Хотя Х-хромосома неактивна на ранних стадиях зародышевых клеток у обоих полов, в оогенезе эта X становится функционально активной (Fong et al., 2002; Kelly et al., 2002). Напротив, в ходе мужского мейоза Х-хромосома никогда не активируется, подвержена преждевременной конденсации и в мейозе особей ХО дополнительно обогащена H3K9me2 (рис. 15.7) (Kelly et al., 2002; Bean et al., 2004). Во время сперматогенеза модификации гистонов прогрессивно утрачиваются со всех хромосом по мере того, как они вступают в мейотические деления и становятся гиперконденсированными для упаковки в сперматиды (рис. 15.7). Предполагают, что гиперконденсация обусловлена замещением гистонов специализированными, сильно основными белками, называемыми протаминами, как это происходит и у других организмов, хотя еще и не показано у червей. Таким образом, геном спермия поступает в яйцеклетку в основном лишенным модификаций гистонов (и, вероятно, лишенным самих гистонов). Это контрастирует с хроматином ооцита, который продолжает демонстрировать значительные уровни большинства активирующих модификаций гистонов даже во время конденсации хромосом в диакинезе (рис. 15.7). Важно отметить, что РНК-полимераза отсутствует на ДНК во время созревания ооцитов и, следовательно, модификации гистонов, сохраняемые хроматином, могут отражать скорее транскрипционный «потенциал», чем транскрипционную активность. Таким образом, зигота наследует два эпигенетически различных генома и, в частности, две Х-хромосомы с очень разными транскрипционными историями — недавно активную, происходящую из ооцита Хт, и происходящую от спермия Хр с незначительной или вовсе никакой транскрипционной активностью в недавнем прошлом. Отметим, что благодаря гермафродитному способу воспроизведения С. elegans и способности гермафродитов спариваться с самцами потомки XX могут унаследовать Хр от своего родителя XX или от родителя ХО.

Вскоре после вхождения в ооцит ДНК спермия одновременно накапливает модификации гистонов и начинает деконденсироваться, образуя мужской пронуклеус. У эмбрионов XX хроматин Хр, в отличие от аутосом, не накапливает во время деконденсации ацетилирование гистона H3 или H3K4me2 (рис. 15.6) (Bean et al., 2004). Однако между Хр и аутосомами нет различий в модификациях гистона Н4. В пронуклеусе ооцита все хромосомы, включая Хт, модифицированы сходным образом и остаются такими в ходе всего эмбриогенеза. Удивительно, что специфичное для Хр отсутствие модификаций H3 поддерживается после репликации ДНК и переживает множественные циклы клеточных делений, а потому было названо «эпигенетическим импринтом». Однако постепенно этот импринт утрачивается; иначе говоря, на Хр все более и более начинают выявляться специфичные для H3 модификации, пока не исчезнут какие-либо явные различия между Хр и другими хромосомами в уровне H3K4me2 (рис. 15.6). Природа этого импринта пока еще не известна, но его постепенная реверсия на протяжении нескольких циклов клеточных делений согласуется с разбавлением этой метки, связанным с репликацией. Поскольку отсутствие модификаций ограничено специфичными для гистона H3 добавками, можно предположить, что то, что замещается, является специфичной для Хр (или более многочисленной в Хр) молекулой, подобной H3, которая либо не модифицирована, либо не способна к модификации; например, это мог бы быть вариант гистона H3. Состав и структура хроматина во время сперматогенеза в настоящее время исследуются.

Этот импринт Хр у эмбрионов XX выявляется как у потомства от скрещиваний (когда сперма происходит от родителя ХО), так и в потомстве от самооплодотворения (когда сперма происходит от родителя XX). Статус спаривания Х-хромосомы в ходе сперматогенеза и, таким образом, «нацеливание» H3K9me2 на Х-хромосому и ее обогащение этой модификацией не играют, следовательно, явной роли в установлении импринта Хр. Однако стабильность этого импринта — то есть число клеточных делений, после которых его все еще можно легко наблюдать — существенно увеличивается в потомстве от спермы, происходящей от родителя ХО, по сравнению со спермой, происходящей от родителя XX (Bean et al., 2004). Следовательно, сборка гетерохроматина на неспаренной ДНК во время мейоза имеет последствия, которые сохраняются на протяжении ранних эмбриональных стадий. Важно отметить, что у млекопитающих наблюдается консерватизм как базирующегося на спаривании мейотического сайленсинга, так и инактивации импринтированной Хр, как это обсуждается в главе 17.

Биохимическая основа этого импринта и его эффектов неизвестна. В противоположность тому, что имеет место у млекопитающих, последствия унаследования обеих Х-хромосом с таким импринтом или без него у червей не очевидны. В самом деле, давно считалось, что генетический импринтинг per se (детально рассмотренный в главе 19) у С. elegans отсутствует, поскольку однородительское наследование любой хромосомы не имеет никаких явных последствий для развития и жизнеспособности. Сообщалось, однако, что Хр предпочтительно и часто теряется в ходе раннего развития в условиях стресса (Prahlad et al., 2003), хотя нет никаких данных о механизме, который мог бы вызывать столь необычное хромосомное поведение. У многих организмов обнаруживается предпочтительная утеря унаследованных от отца хромосом, а в крайних случаях во время эмбрионального развития утрачивается весь отцовский геном (Goday and Esteban, 2001). Описание таких резких различий в регулировании генома, основанных исключительно на поле родителя, от которого происходит данный генетический вклад, дало начало оригинальной концепции генетического импринтинга (обзор см.: Hernck and Seger, 1999). Имеет ли это отношение к эпигенетическому импринтингу, наблюдаемому у С. elegans, предстоит еще выяснить.

Хр оказывается неактивной в ранних эмбрионах XX, тем не менее никогда не сообщалось о каких-либо вредных последствиях патроклинного наследования X (т.е. у животных ХрХр; Haack and Hodgkin, 1991). Уникальный генетический состав Х-хромосомы может помочь объяснить, почему однородительское наследование у С. elegans не является явно вредным. Кроме малого количества спермы и экспрессируемых только в зародышевой линии локусов на Х-хромосоме гены, кодирующие ранние зиготические транскрипты, и гены, требующиеся для раннего эмбрионального развития, также резко «недопредставлены» на Х-хромосоме (Piano et al., 2000; Baugh et al., 2003). Таким образом, большинство генов, продукты которых являются существенными для самых ранних стадий, на протяжении которых Хр является неактивной, вряд ли находятся на X, тем самым оставляя Х-специфичное однородительское наследование без последствий в генетических тестах.

Однако инактивация Хр позволяет понять, почему активация соматической компенсации дозы не полностью задействована у ранних эмбрионов. Сборка компонентов DCC на Х-хромосомах у эмбрионов XX не выявляется с помощью окраски антителами приблизительно до 30-клеточной стадии. Это происходит вскоре после того, как Хр становится полностью декорированной модификациями H3 и, таким образом, предположительно является полностью активированной. Активация соматической компенсации дозы чувствительна к уровням содержания сцепленных с X продуктов, называемых сигнальными элементами Х-хромосомы (XSEs — X signal elements), составляющей часть X соотношения Х:А. Полная или частичная репрессия этих элементов на Хр может сделать ранний эмбрион функционально ХО (т.е. отношение Х:А интерпретируется как равное 0,5). По мере того как Хр реактивируется в ходе все возрастающего числа клеточных делений, уровень транскрипции Х-хромосомы может, наконец, достичь критического порога, при котором ощущается доза, равная двум Х-хромосомам, и X: А равняется 1, включая каскад компенсации дозы. Можно рассматривать это как переключение с материнского/отцовского контроля компенсации дозы на зиготический контроль.

12. Заключительные замечания

В этой точке мы прошли полный круг в отношении специализированного регулирования сцепленных с X локусов у С. elegans. Предполагается, что специальная регуляция дозы этой хромосомы в соматических клетках возникла из различия в плоидности Х-хромосомы между двумя полами, как это произошло и у других видов. Интересно, что зародышевая линия и сома у червей развили различные механизмы, чтобы справиться с этим различием в плоидности X, что может отражать различные требования к экспрессии генов Х-хромосомы в этих тканях. В соматических линиях консервативный комплекс, который в норме используется для конденсации и сегрегации хроматина в митозе и мейозе, оказывается кооптированным и приспособленным для замечательно специфичной двукратной репрессии обеих Х-хромосом у животных XX. Хотя и привлекательно, в концептуальном отношении, представить себе дело так, что «неэффективный» комплекс конденсина мог бы послужить для снижения транскрипционной эффективности вдвое, в настоящее время непонятно, каким образом эта репрессия ограничивается двукратным снижением.

В зародышевой линии Х-хромосомы глобально сайленсированы на ранних стадиях развития зародышевых клеток у животных XX и на всех стадиях развития зародышевых клеток у животных ХО. Система модификаторов хроматина MES участвует в этом сайленсинге у животных XX и, возможно, у животных ХО. Такой сайленсинг допускается отчасти потому, что Х-хромосомы «недонаселены» генами, экспрессируемыми в зародышевой линии. Полагают, что эта малочисленность сцепленных с X генов, существенных для мейоза у обоих полов, возникла в результате отсутствия партнера по спариванию для Х-хромосомы в ходе мужского мейоза и как следствие репрессивных механизмов защиты генома, которые «нацеливают» неспаренные хромосомные сегменты. Следствием глобального сайленсинга Х-хромосомы в зародышевой линии является то, что разница в плоидности X между полами имеет мало значения для этой ткани. Если каким-то сцепленным с X генам, которые работают у обоих полов, фактически удается избежать сайленсинга, тогда возникает вопрос о том, действительно ли зародышевая линия уравнивает свою экспрессию у животных XX в сопоставлении с животными ХО. Ответ на этот вопрос неизвестен. Выравнивание в зародышевой линии было бы связано, вероятно, с иным, чем DCC, механизмом, который действует в соматических тканях.

Зародышевая линия и сома различаются во многих фундаментальных отношениях, и в этой главе освещена различная регуляция Х-хромосомы в них. Одной из возникших интересных тем является кооптация различных предсуществовавших механизмов, таких как использование комплекса, родственного конденсину, для тонкой даун-регуляции экспрессии Х-хромосомы в соме в сравнении с использованием комплекса, родственного PRC2, для сайленсирования Х-хромосом в зародышевой линии. Полагают, что гетерохроматинизация единственной Х-хромосомы у самцов резко изменила «представленность» генов на Х-хромосоме, так что гены, необходимые для общих функций зародышевой линии и раннего эмбрионального развития, существенно «недопредставлены» на этой хромосоме. Х-хромосома и ее регулирование у С. elegans представляют, таким образом, интересный срез эпигенетической регуляции целых хромосом, ее влияния на эволюцию генома и реакций на эту эволюцию.

Литература

Ahmad K. and Golic K.G., 1998. The transmission of fragmented chromosomes in Drosophila melanogaster. Genetics 148: 775-792.

Ahmad K. and Henikoff S., 2001. Centromeres are specialized replication domains in heterochromatin. /. Cell Biol 153: 101-110.

Ahmad K. and Henikoff S., 2002. The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mol Cell 9: 1191-1200.

Aladjem M.I. and Fanning E., 2004. The replicon revisited: An old model learns new tricks in metazoan chromosomes. EMBO Rep. 5: 686-691.

Amor D.J. and Choo K.H., 2002. Neocentromeres: Role in human disease, evolution, and centromere study. Am. J. Hum. Genet. 71: 695-714.

Baarends W.M., Wassenaar E., van der Laan R., Hoogerbrugge J., Sleddens-Linkels E., Hoeijmakers J.H., de Boer P., and Grootegoed J.A., 2005. Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis. Mol. Cell. Biol. 25: 1041-1053.

Bassing C.H., Chua K.F., Sekiguchi J., Suh H., Whitlow S.R., Fleming J.C., Monroe B.C., Ciccone D.N., Yan C., et al., 2002. Increased ionizing radiation sensitivity and genomic instability in the absence of histone H2AX. Proc. Natl Acad. Sci. 99: 8173-8178.

Baum M., Ngan V., and Clarke L., 1994. The centromeric K-type repeat and the central core are together sufficient to establish a functional Schizosaccharomyces pombe centromere. Mol Biol. Cell 5: 747-761.

Bean C.J., Schaner C.E., and Kelly W.G., 2004. Meiotic pairing and imprinted X chromatin assembly in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 36: 100-105.