Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

3. Поддержание транскрипционного сайленсинга

3.1. Компоненты PRC1

Молекулярный анализ продуктов генов PcG выявил структурно разнообразную группу ассоциированных с хроматином белков. PRC1 содержит четыре белка PcG: Polycomb (PC), Polyhomeotic (PH), Posterior Sex Combs (PSC) и Ring 1 (dRingl/SCE) (см. табл. 11.1) (Francis et al., 2001). Они встречаются в стоихометрических количествах, и были идентифицированы дополнительные белки-партнеры в зависимости от материала, используемого для очистки. Из млекопитающих был выделен и очищен родственный комплекс, что заставляет предполагать, что эти четыре субъединицы образуют кор PRC1 (Levine et al., 2002). Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila с использованием антител против белков PRC1 продемонстрировало перекрывающуюся локализацию, которая показывала, что эти белки взаимодействуют на определенном и общем [defined and common] наборе генов-мишеней (рис. 11.6а). Кроме того, приблизительно 100 бэндов, наблюдаемых на хромосомах, дали доказательство того, что гены НОХ являются лишь частью более крупной регуляторной сети, включающей другие генные мишени, подверженные PcG-сайленсингу.

Рис. 11.6. «Нацеливание» PRC1 на PREs на политенных хромосомах

^{(а) Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila для визуализации распределения белка РС. (б) Выравнивание хромосомных плечей, показывающее перекрывание между предсказанными сайтами PRE в геноме Drosophila и цитологически картированными сайтами связывания РС на политенных хромосомах. Два кластера генов НОХ (ANT-C и ВХ-С) являются особо заметными сайтами для PRCls}

Ген РС кодирует белок из 390 аминокислот, содержащий хромодомен на своем аминотерминальном конце. Этот консервативный мотив обладает гомологией с НР1, белком Drosophila, необходимым для формирования гетерохроматина (Раю and Hogness, 1991; глава 5). Впоследствии было найдено, что хромодомен связывается с метальными компонентами в H3K27 и H3K9 (Bannister et al., 2001; Fischle et al., 2003). Еще один консервативный домен присутствует на карбокситерминальном конце. Консерватизм, как и наличие нескольких аберраций в мутантных аллелях, заставляет предполагать наличие важной, но все еще неизвестной регуляторной функции в этой части данного белка. Карбоксильный конец РС необязателен для «нацеливания» этого белка на «молчащие» гены (выполняемого хромодоменом), но, как оказалось, взаимодействует in vitro с нуклеосомами (Breiling et al., 1999). Предстоит выяснить, указывает ли это на еще не открытый узнающий мотив для еще одной модификации гистона. Для Рс2 человека была продемонстрирована SUMO ЕЗ-лигазная активность, что указывает на SUMO-модификации как на важные метки в процессе PcG-сайленсинга (Kagey et al., 2003).

Аминотерминальная часть белка PSC консервативна в протоонкогене bmi-1 позвоночных и гене-супрессоре опухолей mel-18. Этот район содержит мотив С3НС4 (RING finger), который может опосредовать белок-белковые взаимодействия. Этот мотив RING finger оказался связанным с субъядерной локализацией Bmi-1/ Mel-18, которая коррелирует с клеточной трансформацией.

У Drosophila локус polyhomeotic (ph) дуплицирован и состоит из проксимального (ph-p) и дистального (ph-d) генов, сохранивших обширную гомологию. У мышей были идентифицированы гомологичные белки PH. У всех у них имеются общий консервативный «цинковый палец» и домен SAM (известный также как SEP или SPM). Этот домен обнаруживается в еще одном белке PcG, SCM (Sex Combs on the Midleg). Домены SAM участвуют в белок-белковых взаимодействиях, поскольку было продемонстрировано, что они участвуют в гомо- или гетеротипических взаимодействиях с другими белками. Эти данные говорят в пользу предположения о возможной функции в генерировании крупных ядерных комплексов, необходимых для сайленсинга Действительно, белки PcG были локализованы в субнуклеарных фокусах, названных PcG-тельцами, которые могут функционировать как компартменты сайленсинга (Saurin et al., 1998).

Как упоминалось выше, dRINGl первоначально не был распознан как член PcG. Лишь биохимическая очистка обнаружила присутствие этого фактора с мотивом RING finger в PRC1, в котором, как полагают, он играет структурную роль (Francis et al., 2001; Lavigne et al., 2004). Было обнаружено, что белки Ring 1А и RING 1В из PRC1 млекопитающих ассоциированы с убиквитилированным Н2А на неактивной Х-хромосоме, и поддержание этой гистоновой метки зависит от белков Ringl (de Napoles et al., 2004; Fang et al., 2004; Cao et al., 2005; дополнительные детали см. в разделе 4.1 этой главы и в главе 17).

Эти четыре белка составляют коровую структуру PRC1. Однако другие белки PcG, подобные SCM или белку Zeste, оказались связанными с этим комплексом (Otte and Kwaks, 2003). Их молекулярная функция в PRC1 остается неясной, поскольку они, по-видимому, играют дополнительные роли в ядре; в качестве примера можно привести функцию активатора транскрипции, которую играет Zeste. Были идентифицированы еще и другие гены PcG по их роли как регуляторов транскрипции генов кора PcG (Ali and Bender, 2004). А именно, три гена PcG являются находящимися «вверх по течению» регуляторами генов, кодирующих компоненты PRC1. Петли отрицательной обратной связи между компонентами PRC1, а также положительная регуляция компонентов PRC1 со стороны PRC2 еще более заставляют предполагать сложную, кросс-регуляторную сеть между генами PcG для обеспечения тонкой настройки белковых уровней в этих комплексах (рис. 7а). Аналогичным образом, сложные регуляторные взаимодействия были описаны для генов комплекса FIS у Arabidopsis (Baroux et al., 2006).

3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены

Трансгенный анализ кластеров гомеотических генов у Drosophila обнаружил регуляторные элементы, необходимые для поддержания сегмент-специфичной экспрессии генов НОХ. Эти ДНК-элементы — названные Polycomb Response Elements, или PREs — поддерживают сегмент-специфичную экспрессию генов НОХ за рамками фазы эмбриональной инициации. PREs привлекают белки PRC1, будучи интегрированы в эктопические сайты в политенных хромосомах; это позволяет предполагать что они определяют специфичность последовательности для узнавания комплексом PRC1 генов-мишеней и заякоривания на них. Однако тема «нацеливания» PcG оказывается довольно сложной. Размеры функционально охарактеризованных PREs варьируют от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, они содержат консенсусные сайты связывания для многих разных белков, связывающихся с ДНК, и обычно в данном локусе-мишени обнаруживаются два или более PREs. Все охарактеризованные до сих пор PREs происходят от Drosophila и ни один PRE пока еще не был определен у млекопитающих или растений. Несмотря на сложность PREs, удалось идентифицировать четыре консенсусные последовательности-мотива и показать, что они играют роль в функции PRE у Drosophila. Один из этих мотивов (GCCAT) связывается как с Плейогомеотическими (РНО, Pleiohomeotic), так и с Плейогомеотикоподобными (PHOL) белками, которые обладают отчасти избыточными функциями. РНО и PHOL функционируют в «нацеливании» PcG, поскольку они найдены в комплексах PcG, выделенных из экстрактов ранних эмбрионов, обнаруживают совместную иммунопреципитацию с членами как PRC 1, так и PRC2 и связываются с PREs in vitro (рис. 11.5а) (Poux et al., 2001). Недавно значение в рекрутировании PcG было продемонстрировано и для DSP1, который связывается с мотивом GAAA, обнаруженным во многих PREs (Dejardin et al., 2005). Наконец, белки trxG, Zeste и GAF (кодируемый геном Trithorax-like) могут помогать рекрутировать белки PcG к их мишеням.

Вновь разработанный алгоритм, основывающийся на том, что собранные в кластер пары сайтов GAF, Zeste и PHO/PHOL характеризуют PRE, с высокой вероятностью предсказывает известные PREs и, таким образом, может идентифицировать потенциальные гены-мишени PcG в геноме Drosophila (рис. 11.66) (Ringrose et al., 2003). Семейство генов, контролируемых PRE, включает элементы от генов хорошо известных и важных для развития транскрипционных факторов, необходимых для формирования паттерна, до генов, кодирующих факторы, участвующие в регулировании клеточного цикла и старения.

Рис. 11.7. Регуляция и функция PRC 1 входе клеточного деления

^{(а) Кросс-регуляторные взаимодействия между генами PcG, предполагаемые на основе генетических данных. Е(Рс), Pci и Asx — позитивные регуляторы членов кора PRC1, действующих «вверх по течению», Члены PRC2 Esc и E(z) действуют как позитивные регуляторы транскрипции Рс. Видна отрицательная обратная связь от членов кора PRC1 на Psc и dRing 1, а также на Su(z)2. Тонкая настройка уровня генного продукта, вероятно, необходима для хорошо сбалансированных процессов, базирующихся на химическом равновесии, (б) Факторы транскрипции, специфичные для нуклеотидной последовательности (TF) привязывают компоненты PRC1 к PRE. Стабильный сайленсирующий комплекс требует заякоривания PRC1 через хромодомен РС на соседних метилированных «хвостах» гистонов. (в) Возможная модель того, как могут наследоваться состояния дифференциальной экспрессии генов. Процесс межгенной транскрипции помещает позитивные эпигенетические метки (например, ацетилированные хвосты гистонов, варианты гистонов) в PREs, которые контролируют активные гены (PRE 2). Все другие PREs сайленсируются «по умолчанию» (PRE 1). Во время репликации ДНК и митоза только позитивный эпигенетический сигнал нужно передать дочерним клеткам, что гарантирует, что в следующей интерфазе межгенная транскрипция возобновляется в PRE 2, прежде чем сайленсинг «по умолчанию» вновь устанавливается во всех других PREs (а — из Ali and Bender, 2004, переработано)}

PRC1, будучи однажды связанным, взаимодействует с соседними гистонами и генерирует стабильные сайленсирующие комплексы в PREs (Рис. 11.76). Метки H3K27шеЗ, созданные PRC2, действуют как дополнительные места связывания для хромодомена РС (рис. 11.7в). В их отсутствие, как показывает конкуренция с растворимым пептидом метилированного «хвоста» гистона, PRCls диссоциируют со своих генов-мишеней (Czermin et al., 2002; Ringrose et al., 2004; Wang et al., 2004) Открытие у PRC2 активности HKMT и ассоциированных гистоновых меток, типичных для «молчащего» хроматина, позволило предположить новый механизм для установления репрессии PcG. Вслед за катализируемой PRC2 модификацией H3K27me3 PRC1 связывается через хромодомен белка РС и стабилизирует сайленсинг. Это подкрепляется данными о том, что (1) метки H3K27me3 и РС колокализуются на политенных хромосомах и (2) связывание РС утрачивается у мутантов E(z), у которых нет активности HKMT модифицирующей H3 метками H3K27me3 в PREs, помогая рекрутировать РС к его мишеням (рис. L 1.5). Хотя такая модель несомненно привлекательна, ситуация в PRE», по-видимому, более сложная, поскольку PRC2s и PRC1 действуют не последовательно, а, скорее, присутствуют вместе на PREs в раннем эмбриогенезе (рис. 11.56, в). Таким образом, представляется вероятным, что метилирование H3K27 является событием «вниз по течению» после рекрутирования PcG, но играет ключевую роль в установлении «молчащего» состояния.

Эта описанная выше модель демонстрирует параллели с формированием гетерохроматина, где Гетерохроматиновый Белок 1 (НР1) рекрутируется через свой хромодомен к меткам H3K9me, созданным SU(VAR)3-9 (глава 5). Таким образом, продуктивный сайленсирующий комплекс «нацеливается» транскрипционными факторами на определенные элементы нуклеотидных последовательностей ДНК, но, помимо этого, требует поблизости слой соответствующим образом модифицированных гистонов для генерации структуры репрессированного хроматина более высокого порядка (рис. 11.5).

В ходе эволюции PREs оказались на удивление мало консервативными по последовательности. Даже в пределах близкородственных видов Drosophila число, положение и состав PREs существенно варьируют (L. Ringrose and R. Раю, неопубликовано). Это заставляет предполагать, что требования в отношении последовательности, а также положения PREs являются нежесткими и могут быть адаптированными к видоспецифичным требованиям. Тем не менее, компоненты PRC1 высоко консервативны и предположительно используют тот же самый базовый молекулярный механизм (механизмы) для индукции изменений более высокого порядка в хроматине «молчащих» генов-мишеней.

3.3. Установление репрессивных функций с помощью PRC1

Способ, которым связанные с PRE PRCls взаимодействуют с промотором и предотвращают транскрипцию, все еще неизвестен. Заякоривание временно останавливающихся [paused] комплексов PHК-полимеразы в промоторах, предотвращающее инициацию, было приписано взаимодействиям PRE-PRC1, описанным для ре портерных конструктов (Dellino et al., 2004). Кроме того, было показано, что PRC1 противодействует ремоделингу нуклеосом in vitro и индуцирует компактную структуру хроматина. Таким образом, PRC1 потенциально блокирует доступ к ДНК транскрипционных факторов и других комплексов, необходимых для транскрипции (Francis et al., 2004). С помощью алгоритма, описанного выше, предсказывается существование PRE-подобных последовательностей в почти всех промоторах контролируемых PcG генов-мишеней Drosophila. Это позволяет предполагать, что размещение PRC1 и в промоторах, и в регуляторных сайтах могло бы благоприятствовать взаимодействиям между PREs и промоторами и устанавливать стабильно репрессированные хроматиновые структуры, неблагоприятные для транскрипции (Ringrose et al., 2003).

Стабильность сайленсирующих комплексов, как показывает заякоривание через метилированные «хвосты» гистонов, оказывается признаком долговременной репрессивной функции белков PcG. Однако при анализе in vivo на клеточном уровне наблюдается замечательно динамичное поведение. Белки PcG кластеризуются в PcG-тельца, которые варьируют между клетками по величине и составу, заставляя предполагать взаимодействие сайленсирующих комплексов в ядре, которое регулируется в развитии. Более того, анализ динамики маркированных GFP белков РС и PH in vivo обнаружил очень высокую скорость обмена несвязанных белков с их комплексами в сайленсированных мишенях (Ficz et al., 2005). Эти результаты позволяют предполагать, что долговременная репрессия в основном базируется на химическом равновесии между связанными и не связанными белками, а не на высокоаффинной защите сайтов, связывающихся с ДНК.

3.4. Предотвращение наследуемой репрессии антисайленсингом

Связывание PRCls с PREs, по-видимому, индуцируется «по умолчанию», поскольку многие из заякориваюшихся компонентов PcG и белков, связывающихся с ДНК, экспрессируются во всех клетках, и PREs глобально сайленсируют репортерные гены в трансгенных конструктах. Противодействующие белки группы trxG в действительности функционируют не как активаторы, но, скорее, как антирепрессоры (Klymenko and Mbller, 2004; глава 12). Таким образом, для поддержания активной транскрипции гена контролируемого PRE, сайленсинг в этом PRE должен быть предотвращен ткане- и стадиеспецифическим образом. У Drosophila, например, активация генов НОХ контролируется ранним каскадом транскрипционных факторов, кодируемых генами сегментации. Интересно, что эти факторы индуцируют транскрипцию не только генов НОХ, но и межгенных, некодирующих РНК, которые транскрибируются через ассоциированные PREs, часто обнаруживаемые «вверх по течению» или «вниз по течению» (рис. 11.5). Было показано, что транскрипция через PREs необходима для предотвращения сайленсинга и поддержания активного состояния репортерного гена с использованием трансгенных конструктов (Schmitt et al., 2005). Процесс транскрипции, вероятнее всего, ремоделирует хроматин PRE и генерирует активное состояние, характеризующиеся, например, отсутствием репрессивного метилирования гистонов и присутствием ацетилирования гистонов. Таким образом, даже несмотря на то, что белки, связывающиеся с ДНК, и привлекают PRC1 к этому конкретному активированному PRE, гистоновое окружение не разрешает заякоривание РС через H3K27шеЗ и никакой стабильный сайленсинг не будет установлен. Поскольку в системе PcG сайленсинг индуцируется «по умолчанию», эпигенетическое наследование паттерна дифференциальной экспрессии генов требует только передачи активного состояния PRE в ходе репликации ДНК и митоза (рис 11.7в). Каким образом это достигается на молекулярном уровне и какая эпигенетическая метка (метки) отвечает за поддержание активного состояния PRE — все эти вопросы пока еще остаются открытыми. Интересно, что недавно было показано, что в PRE гомеотического гена Ubx у Drosophila некодирующие РНК, продуцируемые на PREs, остаются ассоциированными с хроматином и рекрутируют регулятор trxG, Absent Small или Homeotic discs 1 (ASH1). Разрушение этих РНК с помощью RNAi ослабляет рекрутирование ASH 1 к PRE, заставляя предполагать, что это взаимодействие играет важную роль в эпигенетической активации гомеотических генов путем преодоления сайленсинга, индуцированного PcG «по умолчанию» (Sanchez-Eisner et al., 2006).

4. Репрессия PcG в развитии млекопитающих

4.1. От репрессии гена к репрессии хромосомы

Мутации в компонентах мышиного PRC1 демонстрируют гомеотические трансформации аксиального скелета. Это может вызывать появление дополнительных позвонков как следствие дерепрессии генов НОХ (рис. 11.2д, е) (Core et al., 1997). Кроме того, мутантные мыши обнаруживают тяжелый комбинированный иммунодефицит, вызываемый отсутствием пролиферативных ответов гематопоэтических клеток (Raaphorst, 2005). Роль белков PcG была особенно хорошо изучена на клетках крови, в свете того факта, что большинство линий клеток крови характеризуются их хорошо описанными, специфичными для клеточного типа программами транскрипции. Однако коммитирование и рестрикция линии каким-то образом нуждаются в надежном поддержании при клеточном делении. Оказывается, что у нокаутных по PcG мышей популяции предшественников В- и Т-клеток продуцируются нормально, показывая, что контроль PcG не играет роли в установлении специфичных для линии паттернов генной экспрессии. Однако белки PcG вносят вклад в необратимость выбора линии, а не участвуют в решении следовать по определенному пути развития.

Кроме контроля генов НОХ, паттерны экспрессии которых характеризуют разные линии клеток крови, белки PcG играют главную роль в контроле пролиферации. Ген bmi1, ортолог гена Psc Drosophila, был первоначально идентифицирован как онкоген, который, в кооперации с туе, индуцирует лимфомагенез у мышей (van Lohuizen et al., 1991). Белок Bmi1 контролирует регуляторы клеточного цикла р16INK4а из 19АRF (Jacobs et al., 1999). И Bmi1, и родственный белок Mel-18 являются негативными регуляторами локуса 1NK4C-ARF, необходимого для контроля нормальной лимфоидной пролиферации. Мисрегуляция этой важной контрольной точки [checkpoint] клеточного цикла влияет на апоптоз и старение у мышей (Akasaka et al., 2001).

Белки PcG млекопитающих ассоциированы также с классическим эпигенетическим феноменом инактивации Х-хромосомы (глава 17). Инактивация одной Х-хромосомы в ХХ-клетках самок сопровождается серией модификаций хроматина, в которых участвуют белки PcG (Heard, 2004). В частности, компоненты PRC2, подобно гомологу ESC, Eed (Embryonic ectoderm expression), или гомологу E(Z), Enx1 (табл. 11.1), играют главную роль в установлении меток гистонов, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом. Временная [transient] ассоциация этого PRC2 с Х-хромосомой, покрытой РНК Xist, сопровождается метилированием H3K27. Напротив, мутантные по eed эмбрионы мыши не обнаруживают рекрутирования HKMT Fnx1, и у них не наблюдается никакого метилирования H3K27. Однако отсутствие этих компонентов PRC2 не ведет к полной дерепрессии всей неактивной Х-хромосомы; скорее, в некоторых клетках наблюдаются спорадическая реэкспрессия сцепленных с X генов и увеличение эпигенетических меток, ассоциированных с активным состоянием (H3K9ас и H3K4me3). Это происходит, вероятно, потому, что другие частично избыточные эпигенетические механизмы взамен обеспечивают поддержание одной активной Х-хромосомы.