Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Белки PcG распадаются на два биохимически охарактеризованных класса, образующих репрессивные комплексы Polycomb 1 и 2 (PRC1 и PRC2). Эти два комплекса необходимы для последовательных шагов в репрессии генной экспрессии. Сначала PRC2 обладает модифицирующей гистоны активностью и метилирует H3K27 и (или) H3K9 в генах, являющихся «мишенями» для сайленсинга. Компоненты PRC1 могут затем узнавать такие модификации, связываться с ними и индуцировать соответствующие структурные изменения в хроматине. В то время как белки PRC2 имеются у всех многоклеточных модельных видов, компоненты PRC1 не были идентифицированы у С. elegans и Arabidopsis.

2.1. Компоненты PRC2 и его эволюционный консерватизм

Несколько вариантов PRC2 были выделены из эмбрионов Drosophila, но все эти комплексы содержали четыре коровых белка (Levine et al., 2004): SET-гистонметилтрансфераза Enhancer of Zeste (E(Z)), WD-40-белок ESC, связывающийся с гистонами белок р55 и SupressorofZestel2 (Su(Z)12) (табл. 11.1 ирис. 11.3). Исходя из такого состава, PRC2 первоначально называли комплексом E(Z)-ESC. В этом разделе освещаются молекулярные и биохимические детали того, что известно о разных компонентах PRC2, идентифицированных до сегодняшнего дня у различных модельных организмов.

Рис. 11.3. Консервативные коровые комплексы PRC2

^{Показаны коровые члены PRC2 у D. melanogaster, М. musculus, A. thaliana и С. elegans. Предполагается, что у A. thaliana анцестральный комплекс диверсифицировался на три варианта с дискретными функциями в развитии. У С. elegans коровый комплекс PCR2 содержит только три белка: MES-3 не обладает гомологией ни с каким другим идентифицированным белком PRC2. Различные цвета указывают гомологию, контакты указывают на взаимодействия (из Reyes and Grossniklaus, 2003 и Chanvivattana et al., 2004, с изменениями)}

Ген E(z) кодирует белок из 760 аминокислот, содержащий домен SET, который придает ему активность метилтрансферазы лизинов гистонов (НКТМ). Этому домену SET предшествует домен СХС, или Pre-SET (Tschiersch et al., 1994), содержащий девять консервативных цистеинов, которые связывают три иона цинка и, как полагают, стабилизируют домен SET. В пользу такой структурной роли говорит тот факт, что несколько температурочувствительных аллелей E(z) затрагивают один из этих консервативных цистеинов (Carrington and Jones, 1996). Кроме того, E(z) содержит домены SANT, вовлеченные в связывание с гистонами, и домен С5, необходимый для физического взаимодействия с SU(Z)12.

ESC — это короткий белок из 425 аминокислот, содержащий пять повторов WD40, образующих структуру типа «(3-пропеллер». Это создает платформу для белок-белковых взаимодействий, отводя ESC тем самым центральную роль в PRC2: физически взаимодействовать как с E(z), так и с р55 во всех проанализированных модельных системах.

Белок SU(Z)12 состоит из 900 аминокислот и характеризуется структурой «цинковый палец» С2Н2-типа и карбокситерминальным доменом VEFS. Домен VEFS был идентифицирован как консервативный участок между SU(Z)12 и его тремя гомологами у растений: VRN2, EMF2, FIS2 (см. рис. 11.3). Несколько мутантных аллелей Su(z)12 изменяют этот домен, показывая тем самым, что он необходим для взаимодействия с доменом С5 белка E(Z) (Chanvivattana et al., 2004; Yamamoto et al., 2004).

Генетически белок p55 не был идентифицирован как член PcG — возможно потому, что он участвует во множестве других белковых комплексов, ассоциированных с хроматином (Hennig et al., 2005). Однако биохимически белок р55 был идентифицирован как часть PRC2. Он состоит из 430 аминокислот и содержит шесть повторов WD40, которые физически взаимодействуют с ESC или его ортологами у млекопитающих и растений (Tie et al., 2001; КцЫег et al., 2003a).

Кроме коровых белков PRC2 некоторые варианты этого комплекса содержат деацетилазу гистонов (HDAC) RPD3, или Polycomb-подобный белок (PCL). Взаимодействие с RPD3 заслуживает особого внимания, поскольку деацетилирование гистонов коррелирует с репрессированным состоянием экспрессии генов (глава 10). Различный состав PRC2 отражает, вероятно, динамические изменения в ходе развития или же ткане-специфичные варианты.

PRC2 высоко консервативен у беспозвоночных, позвоночных и растений (рис. 11.3). У С. elegans присутствуют только гомологи E(Z) и ESC: MES-2 и MES-6. Вместе с еще одним неконсервативным белком. MES-3, они формируют маленький комплекс с мол. массой около 230 кДа, необходимый для сайленсинга в гермафродитной зародышевой линии (глава 15). У растений и млекопитающих присутствуют все четыре коровых белка PRC2. Как и у Drosophila, комплекс млекопитающих имеет мол. массу около 600 кДа и играет роль не только в регуляции экспрессии гомеотических генов, но и в контроле клеточной пролиферации, инактивации Х-хромосомы и экспрессии импринтированных генов (см. дополнительные детали в разделе 4 этой главы и в главах, имеющих отношение к этому вопросу).

У растений несколько генов, кодирующих компоненты PRC2, претерпели дупликацию, так что теперь они представлены небольшими семействами генов. У Arabidopsis имеется только один гомолог ESC, FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), но три гомолога E(Z), три гомолога SU(Z)12 и пять гомологов р55 (называемые MSI1-5) (табл. 11.1). Различные комбинации этих белков образуют по крайней мере три разных комплекса, контролирующие специфические процессы развития (рис. 11.3 и 11.4) (Reyes and Grossniklaus, 2003; Chanvivattana et al., 2004).

Из этих комплексов лучше всего изучен комплекс, образованный членами класса FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED (FIS), который играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации в семени (Grossniklaus et al., 2001). Этот комплекс FIS, или МЕА-FIE содержит MEDEA, FIE, FIS2 и MSI1. Как оказалось, комплекс FIS регулирует гены, кодирующие PHERES1 (РНЕ1), транскрипционный фактор с доменом MADS [MADS domain transcription factor]; и MEIDOS, гомолог Skpl, который у дрожжей играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации (КцЫег et al., 2003b). Интересно, что отцовская аллель РНЕ1 экспрессируется на более высоких уровнях, чем материнская аллель. Эта регуляция экспрессии гена посредством геномного импринтинга находится под контролем комплекса FIS, который специфически репрессирует материнскую аллель (КцЫег et al., 2005). Таким образом, как описывается ниже, комплекс FIS имеет общие с его аналогом у млекопитающих функции в регулировании клеточной пролиферации, а также экспрессии импринтированных генов.

Комплекс EMF содержит CLF и EMBRYONIC FLOWER2 (EMF2) (Chanvivattana et al., 2004). Мутации по любому из этих компонентов обнаруживают слабые гомеотические трансформации и фенотип раннего цветения. Комплекс EMF необходим для репрессии гомеотических генов, чье комбинированное действие определяет идентичность органов цветка (Goodrich et al., 1997). Таким образом, комплекс EMF обладает функцией в поддержании репрессированного состояния гомеотических генов, сходной с функцией PRC2 у Drosophila и позвоночных (рис. 11.2). Однако гомеотические гены у растений кодируют не гомеодоменные белки, а, скорее, другие транскрипционные факторы, принадлежащие к семействам MADS-домена и специфичного для растений АР2-домена. Сильные [strong] мутанты EMF2, однако, имеют более резко выраженные [severe] фенотипы, когда их сеянцы производят цветки сразу же после прорастания, минуя вегетативную фазу развития (Yoshida et al., 2001). Таким образом, комплекс EMF играет роль как в раннем развитии, где он предотвращает немедленное цветение, так и позже, в ходе органогенеза цветка (Chanvivattana et al., 2004). На обеих стадиях комплекс EMF репрессирует гомеотические гены цветка, такие как AG и APETALA3 (АРЗ) (рис. 11.4). Белки FIE и MSI1, относящиеся к классу FIS, также вовлечены в контроль экспрессии гомеотических генов (рис. 11.3 и 11.4). Поскольку мутации в обоих этих белках вызывают связанную с материнским эффектом эмбриональную летальность, эта функция была обнаружена лишь тогда, когда аллели типа частичной утраты функции можно было изучать на более поздних стадиях развития (Kinoshita et al., 2001; Hennig et al., 2003).

Наконец, комплекс VRN играет ключевую роль в хорошо известном эпигенетическом процессе — яровизации (продолжительное воздействие низкой температуры). Яровизация индуцирует цветение у озимых однолетников, но этот эффект виден только после многих клеточных делений (рис. 11.4). Клетка растения будет помнить, что она была яровизирована, на протяжении многих месяцев или даже лет после холодного периода. Эта клеточная память поддерживается при пассажах в клеточной культуре, но не от одного поколения к следующему (Sung and Amasino, 2004а). Этот ответ на яровизацию опосредуется генами VERNALIZATION (VRN). Обнаружили, что VRN2 кодирует гомолог SU(Z)12 (Gendall et al., 2001), который взаимодействует с гомологами E(Z) растений, CLF и SWINGER (SWN) в двугибридных тестах у дрожжей (Chanvivattana et al., 2004). Переход к цветению контролируется не только яровизацией, но включает восприятие эндогенных (стадия развития и возраст) и экзогенных (длина дня, условия освещения, температура) факторов. Генетический анализ позволил определить четыре пути: (1) автономный путь конститутивно репрессирует цветение, (2) фотопериодический путь ускоряет цветение в условиях длинного дня, (3) яровизационный путь индуцирует цветение в ответ на действие низкой температуры и (4) гиббереллины стимулируют цветение. Ген сроков цветения FLC, содержащий MADS-бокс, является ключевым интегратором реакции цветения: он репрессирует цветение. Экспрессия FLC редуцируется как яровизанионным, так и автономным путями. В то время как первоначальная репрессия FLC не зависит от комплекса VRN, поддержание репрессии требует VRN2, который изменяет организацию хроматина в локусе FLC (Gendall et al., 2001). Важно отметить, что один из компонентов автономного пути — это гомолог р55, FVE (или MS 14), который влияет на реакцию по срокам цветения, но не действует в яровизационном пути (Ausin et al., 2004; Kim et al., 2004). Поскольку ни о каких биохимических исследованиях комплекса VRN не сообщалось, его точный состав в настоящее время неизвестен (рис. 11.3 и 11.4).

2.2. Модифицирующая хроматин активность PRC2

Каким образом PRC2 опосредует свое репрессирующее действие? Несколько белков PcG и trxG имеют домены SET, в том числе компонент PRC2, E(Z). Обнаружение того факта, что белки с доменом SET обладают активностью HKMT (Rea et al., 2000), позволило предположить, что в функцию PcG входит метилирование гистонов. Действительно, было показано, что комплексы PRC2 у млекопитающих и Drosophila метилируют гистон H3 по лизину 27 (H3K27) и, в меньшей степени, по H3K9 как in vivo, так и in vitro (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Mbller et al., 2002). Эти гистоновые метки обычно ассоциируются с транскрипционно «молчащим» состоянием. Более того, метилирование H3K9 и H3K27 было связано с репрессированными гомеотическими генами комплекса bithorax (Mbller et al., 2002). Однако лишь метилирование H3K27 утрачивалось у мутантов по E(z), подчеркивая тем самым значение метилирования H3K27 в PcG-сайленсинге. В отличие от белка SU(VAR)3-9, который сам метилирует H3K9, белки E(Z) сами по себе не обладают активностью HKMT H3K27. Наименьший комплекс, действующий как HKMT, также требует ESC и SU(Z) 12, которые могут иметь модулирующие функции. Недавно было показано, что комплексы PRC2 могут также метилировать Н1К26 (Kuzmichev et al., 2004). Разные изоформы гомолога ESC у млекопитающих, Eed, определяют специфичность PRC2 млекопитающих по отношению к метилированию Н1К26 versus H3K27 (Kuzmichev et al., 2004). Однако функциональное отношение метилирования Н1К26 к PcG-сайленсингу остается неясным.

Рис. 11.4. Участие различных PRC2 на разных стадиях развития растений

^{В жизненном цикле растения разные варианты PRC2 (см. рис. 11.3) контролируют процесс развития. (А) Просветленная [cleared] семяпочка дикого типа с женским гаметофитом в центре. Комплекс FIS репрессирует гены-мишени, контролирующие пролиферацию центральной клетки; как и у всех мутантов классаfls, эта клетка пролиферирует в отсутствие оплодотворения. Приблизительно во время оплодотворения требуется также МЕА для поддержания низкого уровня экспрессии MEAT, но эта активность не зависит от других компонентов комплекса FIS. (Б) Срез семени дикого типа, содержащего зародыш и эндосперм, окруженный семенной оболочкой [seed coat]. После оплодотворения комплекс FIS участвует в контроле клеточной пролиферации в зародыше и эндосперме. Он поддерживает низкий уровень экспрессии РНЕ1 и необходим для удержания отцовской аллели МЕАР в «молчащем» состоянии. (В) Проростки дикого типа (справа) и мутанта ет/2 (слева), 21-й день после прорастания. Проросток ет/2 произвел цветок с гомеотическими трансформациями, но не дал листьев. Комплекс EMF предотвращает цветение и репрессирует гомеотические гены цветка, такие как AG, АРЗ и другие. (/) Яровизированное (справа) и неяровизированное (слева) растения; второе из них характеризуется продолжительной вегетативной фазой и образованием многочисленных листьев. Во время вегетативной фазы развития экзогенные и эндогенные сигналы индуцируют цветение. Яровизация ведет к репрессии цветкового репрессора FLC и таким образом стимулирует цветение. Поддержание этой репрессии зависит от комплекса VRN. (Д) Цветок Arabidopsis дикого типа. Во время органогенеза цветка комплекс EMF регулирует цветковые гомеотические гены, определяющие идентичность органов цветка. (А — любезно предоставлено J.M. Мооге и U. Grossniklaus; Б — любезно предоставлено J.-P. Vielle-Calzada и U. Grossniklaus; В — перепечатано, с любезного разрешения, из Moon et al., 2003 [©ASPB]; Г— перепечатано, с любезного разрешения, из Page and Grossniklaus, 2002 [©Macmillan].)}

У растений HKMT-активность комплексов PRC2 еще не была продемонстрирована in vitro. Однако исследования регулирования FLC показали, что яровизация индуцирует утрату ацетилирования и увеличение метилирования H3K9 и H3K27, главным образом в первом интроне этого гена (Bastow et al., 2004; Sung and Amasino, 2004b). У мутантов vm2 обе метки метилирования утрачены, что предполагает участие комплекса VRN в установлении этих репрессивных меток метилирования гистонов. У двух других мутантов, vrnl и vernalization in-sensitive3 (vin3), исчезает лишь метка H3K9me2. VRN 1 и VIN3 кодируют транскрипционные факторы семейств ВЗ-домена и гомеодомена, соответственно, но точный молекулярный механизм их участия в модификации хроматина в настоящее время неизвестен

Исходя из многочисленных исследований, выполненных к сегодняшнему дню, основной функцией PRC2 представляется обладание активностью HKMT, но у некоторых вариантов PCR2 имеются и другие активности, модифицирующие хроматин. Ген Rpd3 кодирует HDAC, которая, как полагают, участвует в PcG-сайленеинге (Tie et al., 2001). Однако, хотя мутации rpd3 усиливают фенотипы PcG, сами они не обнаруживают типичных гомеотических трансформаций. Тот факт, что RPD3 не присутствует во всех препаратах PRC2, может, таким образом, отражать либо слабое общее взаимодействие, либо ткане- и стадиеспецифичное взаимодействие с коровыми компонентами PRC2. Взаимодействие RPD3 с PRC2 представляет собой интересное партнерство, поскольку активности и HKMT, и HDAC ассоциируются с «молчащим» хроматином и в сочетании могут еще больше укреплять транскрипционно «молчащие» состояния.

2.3. Динамическая функция PRC2 в развитии

Как указывалось выше, коровые комплексы PRC1 и PRC2 ассоциируются с разными факторами, которые могут играть роль в рекрутировании комплексов PcG к тканеспецифичным локусам-мишеням или в модулировании их активности (Otte and Kwaks, 2003). Разные этапы PcG-репрессии, показанные на рис. 11.5, иллюстрируют стадиеспецифичные композиции комплексов PcG в эмбриогенезе Drosophila. До сих пор было трудно охарактеризовать различия в отношении разных тканей или клеточных типов у мух, поскольку для биохимической очистки обычно используются экстракты из целых эмбрионов. Однако исследования, выполненные на млекопитающих и растениях, ясно показывают, что комплексы PcG представлены по разному в различных конкретных тканях и что их состав изменяется в ходе клеточной дифференцировки (Chanvivattana et al.. 2004; Kuzmichev et al.. 2005; Baroux et al., 2006). У млекопитающих уровни экспрессии генов PcG различаются в огромной степени от одной клеточной линии к другой. Комплексы PcG могут различаться даже между генами-мишенями в одной и той же клетке, что заставляет предположить высоко динамичное поведение на разных стадиях развития.

Рис. 11.5. Последовательность событий, ведущих к зависимому от PcG репрессированному состоянию экспрессии генов у эмбрионов Drosophila

^{Исходное состояние экспрессии регулируемого PRE гена определяется активностью регуляторов транскрипции — либо репрессоров (TR), либо активаторов (ТА) транскрипции. Транскрипция через PRE предотвращает установление состояния «OFF» («ВЫКЛ.») и приводит к зависимому от trxG состоянию «ON» («ВКЛ.») (детали см. рис. 12.8). (а—б) Нетранскрибируемый PRE связывается со специфическими белками, связывающимися с ДНК (например, РНО, PHOL, DSP1 или GAF), которые участвуют в рекрутировании раннего комплекса PcG, содержащего белки и PRC1, и PRC2. (в) Этот ранний комплекс PcG маркирует хроматин путем зависимого от E(Z) метилирования гистонов. (г) Поддержание «молчащего» состояния происходит через взаимодействия двух разных комплексов, PRC 1 и PRC2, в отсутствие исходного транскрипционного репрессора. Поддержание PRC1 стабилизируется посредством связывания через хромодомен ЗС. (d) PRC1 может компактизировать хроматин, устанавливая далее плотно конденсированный, «молчащий» хроматин}

У Drosophila белки PcG поддерживают репрессированные состояния гомеотических генов, установившиеся в раннем эмбриогенезе, фиксируя тем самым «решения» по развитию. Коль скоро «молчащее» состояние мишени PcG зафиксировано, она будет оставаться в этом состоянии весь остаток жизни особи. У растений аналогичная ситуация может возникать с комплексом VRN: будучи однажды яровизирован, ген-мишень (гены-мишени) будет перманентно инактивированным и будет «переустановлен» только в следующем поколении. Однако другие растительные комплексы PRC2, по-видимому, более быстро реагируют на стимулы, связанные с развитием или исходящие из окружающей среды. Например, одной из функций комплекса FIS является репрессия клеточной пролиферации в отсутствие оплодотворения. После оплодотворения, однако, клеточная пролиферация быстро индуцируется, предположительно через дерепрессию генов-мишеней PcG. Это показывает, что PcG-репрессия является состоянием «по умолчанию», которое должно быть преодолено неким неизвестным механизмом, чтобы стал возможным нормальный ход развития. Инактивация комплексов PcG как часть нормального жизненного цикла растения может объяснить отсутствие белков PRC1 у растений (рис. 11.4). PRC1 играет важную роль в перманентной, стабильной и длительной инактивации генов-мишеней. Такая перманентная инактивация была бы вредной для развития растения, где нередко PcG-репрессия снимается после соответствующих стимулов.