Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2.2. Транскрипционные факторы

Вступление лимфоидных прогениторов на путь В-клеток зависит от транскрипционного фактора Е2А (Tcfe2a) типа «спираль-петля-спираль», раннего фактора В-клеток EBF1 и от белка Рах5 (BSAP), имеющего парный (спаренный) домен (paired domain protein) (рис. 21.4). Е2Аи EBF1 координированно активируют экспрессию генов, специфичных для В-клеток, которые важны для выработки ранних про-В-клеток (Busslinger, 2004). Тем не менее, активация транскрипционной программы, специфичной для В-клеток, недостаточна для коммутирования ранних прогениторов к В-лимфоидной линии в отсутствие Рах5. В костном мозге гомозиготная мутация Рах5 останавливает развитие В-клеток на стадии ранней про-В-клетки (Nutt et al., 1997). Pax5-/ про-В-клетки сохраняют мощный потенциал самообновления и развития, характерный для некоммитированных лимфоидных прогениторов (Nutt et al., 1999). Интересно, что эктопическая экспрессия миелоидных факторов транскрипции эффективно индуцирует переключение линии с лимфоиднои на миелоидную дифференциацию в прогениторах Рах5-/-, показывая, что про-В-клетки Рах5-/- in vitro являются клонируемыми лимфоидными прогениторами с латентным потенциалом миелоидной дифференцировки (Busslinger, 2004). Важно, что восстановление экспрессии Рах5 подавляет этот мультилинейный потенциал про-В-клеток Рах5-/- одновременно стимулируя их развитие в зрелые В-клетки (Nutt et al., 1999). Эти эксперименты позволяют определить Рах5 как критичный фактор коммутирования В-линии, который ограничивает возможности развития лимфоидных прогениторов только путем развития В-клеток.

Рис. 21.3. Схема развития В-клеток

^{Гематопоэтические стволовые клетки (HSC) дифференцируются через обозначенные стадии развития в секретирующие иммуноглобулин плазматические клетки: LMPP — лимфоид-праймированные мультипотентные прогениторы; СМР — общий миелоидный прогенитор; ELP — самые ранние прогениторы лимфоцитов: CLP — общий лимфоидный прогенитор. Части 1-111, указанные внизу рисунка, обозначают стадии лимфопоэтического развития, эпигенетические механизмы которых были исследованы и которые обсуждаются в этой главе}

Рис. 21.4. Транскрипционный контроль раннего лимфопоэза

^{Прогениторы естественных киллеров (NK), линий В- и Т-клеток развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (HSC) под контролем обозначенных факторов транскрипции. Детальное описание см. Bussinger (2004)}

Некоммитированные гематопоэтические прогениторы беспорядочно экспрессируют гены с различными программами посредством процесса, который известен как «праймирование линии» (Miyamoto et al., 2002). В соответствии с этим открытием, про-В-клетки Рах5-/- экспрессируют не только гены, характерные для про-В-клеток, но и гены программ, специфичных для других линий (Nutt et al., 1999). При линейном коммитировани Рах5 выполняет двойную роль, активируя специфичные для В-клеток гены и одновременно подавляя гены, не подходящие для линии (рис. 21.5) (Nutt et al., 1999). Рах5 активирует несколько генов-мишеней, кодирующих существенные компоненты сигнального пути, связанного с рецептором пре-В-клеток (BCR), такие, как трансдуцирующая сигнал цепь Ig? (mb-1, Cd79a), стимулирующие корецепторы CD, 19 и CD1, а также центральный адаптерный белок BLNK (рис. 21.5) (Busslinger). Таким образом, функция трансактивации Рах5 облегчает передачу сигнала от pre-BCR и BCR, образуя важные контрольные точки в развитии В-клеток. С другой стороны, гены, репрессированные Рах5, кодируют избыток выделенных белков, молекулы клеточной адгезии, передатчики сигналов и белков ядра, которые экспрессируются в эритроидных, миелоидных и (или) Т-лимфоидных клетках (рис. 21.5) (Delogu et al., 2006). Среди них — гены Csflr (М-CSFR) и Notchl. что является хорошим примером того, как их Рах5-зависимая даун-регуляция делает коммутированные В-клетки больше не реагирующими на миелоидный цитокин M-CSF (Nutt et al., 1999) или на Notch лиганды, индуцирующие Т-клетки (Busslinger, 2004). Следовательно, репрессивная функция Рах5 содействует коммитированию В-клеток, прекращая работу ненужных сигнальных систем. Взаимодействуя с ко-репрессорами белкового семейсва Groucho, Pax5 может рекрутировать деацетилазы гистонов (HDACs) к регуляторным элементам, результатом чего является репрессия генов (Linderson et al., 2004).

Рис. 21.5. Двойная роль Рах5 в развитии В-клеток

^{Рах5 активирует гены, специфичные для В-клеток, участвующие в (пре)ВСВ-сигналинге и подавляет неприемлемые для линии гены, необходимые для трансдукции сигнала в миелоидных (FcRy, Csfr) или Т-лимфоидных (Notchl, CD28, Grap2)}

Е2А, EBF1 и их гены-мишени обычно экспрессируются в Pax-/- про-В-клетках, указывая, что Рах5 в развитии В-клеток функционирует «вниз по течению» от Е2А и EBFT1 (Nutt et al., 1997; Busslinger, 2004). Согласно этим наблюдениям, транскрипты Рах5 отсутствуют и в прогениторах E2A-/- или EBFI-- (Ikawa et al., 2004; Medina et al., 2004). Прогениторы E2A-/- экспрессируют EBF1 на низком уровне, в то время как Е2А нормально транскрибируются в прогениторах EBF1- (Medina et. al., 2004). Более того, ретровирусное восстановление экспрессии EBF1 в прогениторах Е2А-- активирует транскрипцию Рах5 и таким образом инициирует дифференцировку про-В-клеток (Seet et al., 2004). Отсюда следует, что эти три транскрипционных фактора стимулируют раннее развитие В-клеток в генетической иерархии E2A-EBF1-Pax5. Тем не менее, в пределах В-лимфоидной линии экспрессия EBFI поддерживается благодаря регуляции белком Рах5, основанной на обратной связи (рис. 21.4) (Horher et al., 2001; Fuxa et al., 2004).

2.3. Эпигенетический контроль экспрессии генов

В любой клетке многоклеточного эукариотного организма большая часть генов транскрипционно подавлена и избирательно активируется только в специфичных путях развития. Репрессия генов опосредуется многочисленными слоями эпигенетических механизмов, включая метилирование ДНК, модификации гистонов, позиционирование нуклеосом и структуру хроматина более высокого порядка (Smale, 2003). Первое проникновение в то, как снимается репрессия генов в начале развития В-клеток, было обеспечено анализом специфичного для В-клеток гена Cd79а (mb-1, Igw, Maier et al., 2004) Промотор гена Cd79a содержит функциональные узнающие последовательности для трех транскрипционных факторов Е2А, EBF1 и Рах5, в дополнение к Ets и Runx-связывающим сайтам (рис. 21.6) (Maier etal., 2004). Этот участок транскрипционного контроля метилирован по динуклеотидам CpG в HSCs, частично деметилирован в CLPs и полностью деметилирован в коммитированых про-В-клетках (Maier et al., 2004). Промотор Cd79a также полностью метилирован в прогениторах Е2А-/- или EBF1, но может быть деметилирован синергическим действием EBF1 и Runxl, что вместе с Рах5 ведет к транскрипционной активации гена mb-1 в коммитированныхпро-В-клетках (рис. 21.6) (Maieretal., 2004). Таким образом, в раннем развитии В-клеток EBF1 и, возможно. Е2А функционируют как «пионерские» факторы, инициируя эпигенетические изменения, необходимые для активации генов в процессе дифференцировки ранних прогениторов в коммитированные про-В-клетки. Несмотря на то, что изменения в модификации гистонов и структуре хроматина еще не были исследованы, вполне вероятно, что Е2А и Рах5 вносят вклад в локальное образование открытого ацетилированного хроматина путем их взаимодействия с комплексами ацетилтрансфераз гистонов (HAT) SAGA и p300/CBR (Massari et al., 1999; Bariev et al., 2003).

Puc. 21.6. Эпигенетическая активация гена Cd79a в раннем лимфопоэзе

^{На схеме промотор Cd79a(mb-1, Iga) показан вместе с паттерном метилирования (me) CpG и последующим связыванием с различными факторами транскрипции в процессе перехода HSCs в коммитированные про-В-клетки (Maier et al., 2003)}

3. Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов

3.1. Регуляция перестроек генов рецепторов антигенов в процессе развития

Ведущий принцип в системе приобретенного иммунитета заключается в том, что каждый вновь образованный лимфоцит узнает уникальный антиген и что общее разнообразие лимфоцитов достаточно велико, чтобы нейтрализовать любой возможный антиген С этой целью, В- и Т-клетки экспрессируют специфичные для данной клеточной линии рецепторы антигенов, опосредующие зависимый от антител гуморальный или клеточный иммунитет. BCR состоит из тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) и легкой цепи (IgL) типа Ig? или Ig?. Т-клетки линии ??, составляющие у мыши и у человека большинство Т лимфоцитов, экспрессируют рецептор Т-клеток (TCR, T-cell receptor) — ?-полипептид, связанный с TCRa, тогда как функционально отличающиеся Т-клетки уб содержат на своей поверхности TCRy, спаренный с TCR5. Эти белки-рецепторы антигенов кодируются большими генными локусами, содержащими дискретные генные сегменты: V (variable), D (diversity) и J (joining), которые в процессе развития лимфоцита собираются посредством V(D)J-рекомбинации в функциональный ген. Многообразие генных сегментов D, J и особенно V, в сочетании с случайным характером их рекомбинации, отвечает за практически неограниченное разнообразие иммунного репертуара (Bassing et al., 2002).

Механика V(D)J-рекомбинации на уровне ДНК довольно проста. Все V, D и J генные сегменты фланкированы рекомбинационными сигнальными последовательностями (RSSs), которые состоят из относительно консервативных гептамерных и нонамерных элементов, разделенных спэйсерами либо из 12, либо из 23 пар нуклеотидов. Лимфоид-спепифичные белки-рекомбиназы RAG1 и RAG2 при помощи белков группы высокой мобильности собирают 12 и 23 нуклеотидные RSSs в синаптический комплекс и затем производят двухцепочечные разрывы ДНК между RSSs и кодирующими сегментами. Эти разрывы ДНК впоследствии обрабатываются и вновь связываются вездесущими факторами репарации, относящимися к механизму негомологичного соединения концов с образованием кодирующих и сигнальных соединений (Bassing et al., 2002). Простота процесса V(D)J-рекомбинации на уровне матрицы ДНК выдвигает логистические проблемы в отношении сборки различных рецепторов антигенов, потому что белки RAG экспрессируются во всех незрелых В- и Т-лимфоцитах. Следовательно, должна иметь место строгая регуляция, чтобы ограничить доступ белков RAG только к специфичным подгруппам всех субстратов рекомбинации (Yancopoulos and Alt, 1985; Stan-hope-Bakeret al., 1996).

V(D)J-рекомбинация строго контролируется специфичным для клеточной линии и стадии развития образом. В пределах В-лимфоидной линии локус IgH в про-В-клетках реорганизуется до рекомбинации генов Ig? and Ig? в пре-В-клетках, тогда как гены TCR? и TCR? перестраиваются, соответственно, в про-Т-и пре-Т-клетках. Более того, V(D)J-рекомбинация гена IgH осуществляется в определенном временном порядке с перестройками DH-JH, предшествующими Ун-01н-рекомбинации Перестройки локуса TCRp в ходе развития про-Т-клетки происходят в таком же порядке (D?-J? перед V?-DJ?). Таким образом, должны существовать контрольные механизмы, чтобы защитить все гены от опосредованного RAG-расщепления в ходе D-J-рекомбинации и облегчить перестройку лишь одного из сотни генов У во время y-DJ-рекомбинации Следовательно, процесс производства рецептора антигена полностью зависит от точной регуляции доступности RSSs для действия рекомбиназы RAG S.

Успешная V-DJ-peкомбинация гена IgH или TCR? ведет к экспрессии белка Ig? или TCR? как части пре-BCR- или пре-TCR-комплекса, который работает как важная контрольная точка, чтобы ингибировать V-DJ-рекомбинацию второй DJ-реорганизованной аллели и стимулировать развитие пре-В или пре-Т-клеток, инициирующее перестройки в генах IgL или TCR?, соответственно. Наконец, экспрессия BCR или TCR, компетентных к сигналингу, полностью блокирует V(D)J-рекомбинацию с помощью транскрипционной репрессии генов RAG S в незрелых В- или Т-клетках (Jankovic et al., 2004). Сигналинг ауто реактивного BCR может, однако, возобновить перестройку гена легкой цепи иммуноглобулина, что приводит к производству BCR с новой антигенной специфичностью (редактирование рецептора; Jankovic et al., 2004). Более того, сигналинг цитокина IL-7 необходим для стимулирования рекомбинации гена TCR? в про-Т-клетках (Schlissel et al., 2000). Следовательно, V(D)J-рекомбинация контролируется не только изнутри (ядерными механизмами, специфичными к типу клеточной линии и стадии развития), но также и извне (сигналами, образуемыми на поверхности клетки). Ограничения V(D)J-рекомбинации, специфичные для данных стадии развития и локуса, в шачительной степени накладываются на эпигенетическом уровне (Krangel, 2003). В нелимфоидных клетках гены Ig и TCR присутствуют в недоступном хроматине, так как в клетках почек белки RAG, экспрессирующиеся экзогенно, без труда расщепляют субстраты рекомбинации, привнесенные с трансфецированной эписомой, но не эндогенные гены рецепторов антигена (Romanow et al., 2000). Более того, рекомбинантные белки RAG, добавленные к изолированным ядрам лимфоцитов, могут расщеплять только ген Ig или TCR, который активно подвергается V(D)J-рекомбинации на стадии развития, используемой для подготовки ядра (Stanhope-Baker et al., 1996).

Следовательно, линейная специфичность и временное упорядочение перегруппировки генов вызывается последовательным открыванием локального хроматина, что делает специфичные RSSs доступными для V(D) J-рекомбиназы. Способность хроматина как защищать RSSs, так и управлять их расщеплением, предполагает существование «хроматинового кода», который маркирует сайты рекомбинации и (или) облегчает опосредованное RAG расщепление.

Ацетилирование гистонов на лизиновых остатках является не только характерной чертой открытого хроматина, но также играет важную роль в определении доступности хроматина локусов Ig и TCR, так как оно разделяет домены рекомбинационно-компетентных сегментов генов (McMurry and Krangel, 2000; Chowdhury and Sen, 2001). Анализ состояния ацетилирования гистонов выявил ступенчатую активацию дискретных доменов хроматина в локусе IgH (Chowdhury and Sen, 2001). Перед рекомбинацией V(D)J первым гиперацетилируется геномный участок длиной 120 тыс. пар нуклеотидов, окружающий генные сегменты DH, JH и С. Вслед за этим перестройки DH-JH индуцируют ацетилирование гистонов и перестройки генов VH, проксимальных по отношению к DH (Chowdhury and Sen, 2001). Наконец, дистальный домен длиной 2 млн. пар нуклеотидов, содержащий большинство генов VH, оказывается активированным сигналом IL-7 (Chowdhury and Sen, 2001). Детальный анализ локуса TCRa/b в развивающихся Т-клетках также выявил полное перекрывание участков, характеризующихся гиперацетилированием гистона H3 и доступностью для рекомбиназы V(D)J (McMurry and Krangel, 2000). Следовательно, ацетилирование гистонов оказывается существенной частью паттерна модификации хроматина, который контролирует инициацию и (или) развитие рекомбинации (Krangel, 2003).

Однако самого по себе ацетилирования недостаточно для того, чтобы облегчить рекомбинацию, поскольку ингибиторы деацетилаз гистонов имеют слабое влияние на рекомбинацию V(D)J in vivo (McBlane and Boyes, 2000). Более того, в про-В-клетках наблюдалось поражающее несоответствие между высоким уровнем ацетилирования гистона H3 и слабой рекомбинацией H3 (Hesslein et al., 2003; Suetal., 2003). Нормальные уровни ацетилирования гистонов в кластере генов VH, дистальных по отношению к DH, не поддерживают дистальную рекомбинацию VM-DJH в про-В-клетках без метилтрансферазы гистоновых лизинов (НКМТ) Ezh2, которая триметилирует гистон H3 по лизину 27 (H3K27me3) (Su et al., 2003). Тот факт, что более высокие уровни H3K27me3 ассоциируются с дистальными, а не проксимальными генами VH, предполагает домен-специфическую роль метилирования H3K27 в рекомбинации генов VH (Su et al., 2003). Избирательность регуляции, осуществляемой Ezh2 для локуса IgH, подчеркивается равной эффективностью рекомбинации гена TCRp у дикого типа и у дефицитных по Ezh2 про-Т-клеток (Su et al., 2005). Следовательно, дополнительные модификации хроматина, вероятно, участвуют в контроле V(D)J-рекомбинации проксимальных генов Vhb про-В-клетках и TCRp-перестроек в про-Т-клетках. Диметилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me2) — это активная гистоновая метка, которая также коррелирует с доступным состоянием сегментов генов IgH и TCRft (Morshead et al., 2003). Напротив, диметилирование H3 по лизину 9 (H3K9me2) — это репрессивная хроматиновая метка, которая обнаруживает отрицательную корреляцию с V(D)J — рекомбинацией сегментов генов IgH и TCRp (Morshead et al., 2003). Важная роль H3K9me2 в подавлении рекомбинации была недавно продемонстрирована путем таргетинга H3K9 НКМТ G9a на PDp 1 — промотор зародышевой линии (минилокус TCRp), что предотвратило перестройки V(D)J посредством перевода локального хроматина в недоступное состояние (Osipovich et al., 2004).

Паттерн модификации гистонов, облегчающий доступ V(D)J-рекомбиназе, должен быть установлен с помощью процессов, которые происходят в пределах локусов рецептора антигена до перестройки. Прежде чем картирование модификаций гистонов стало экспериментально осуществимым, уже было известно, что в зародышевой линии транскрипция короткой смысловой РНК с сегмента неперестроенного гена предшествует рекомбинации V(D)J (Yancopoulos and Alt, 1985). Возможная роль транскрипции в контролировании доступности локуса была в дальнейшем подтверждена рядом открытий, демонстрирующим, что энхансеры и промоторы, расположенные в пределах локусов рецептора антигена, необходимы для того, чтобы осуществилась рекомбинация V(D)J. Делеция эндогенных энхансеров и промоторов уменьшает или аннулирует рекомбинацию V(D) J локусов рецептора антигена, тогда как вставка дополнительных энхансеров, специфичных для линии, ведет к новому паттерну рекомбинации V(D)J (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Многочисленные промоторы, ассоциированные с сегментами V, D и J, контролируют перестройки последовательностей, проксимальных по отношению к промотору, в пределах относительно коротких расстояний, тогда как энхансеры приводят в действие контроль над рекомбинацией V(D)J на больших расстояниях (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Сборка на промоторе комплекса пре-инициации может локально разрушить нуклеосомы и таким образом облегчить доступ ферментам рекомбинации, даже в отсутствие изменений в модификации гистонов. Более вероятно, однако, что промоторы активно принимают участие в установлении хроматиновой структуры, разрешающей рекомбинацию, так как элонгирующий комплекс РНК-полимеразы 11 несет свою собственную гистоновую ацетилтрансферазу, которая может способствовать распространению ацетилирования гистонов вдоль транскрибируемых участков (Orphanides and Reinberg, 2000). Транскрипция генов также приводит к локальному обмену зависимого от репликации гистона H3 на замещающий его вариант H3.З, который предположительно поддерживает доступное состояние хроматина транскрибируемых участков (Chow et al., 2005; Mito et al., 2005).

Как было упомянуто выше, каждый локус рецептора антигена содержит сотни RSSs, хотя лишь немногие из них будут расщеплены в индивидуальном лимфоците на определенной стадии развития. Таким образом, потенциально возможно, что вариации в последовательности нуклеотидов ДНК индивидуальных сайтов RSS также могут вносить свой вклад в эффективность их расшепления. Анализ искусственных субстратов V(D)J-рекомбинации в самом деле продемонстрировал, что встречающиеся в естественных условиях различия в элементах гептамера и нонамера RSS, так же как и в менее консервативном спэйсере и во фланкирующих кодирующих последовательностях, влияют на частоту рекомбинации и таким образом вносят свой вклад в дифференциальное использование конкретных — V, D и J-сегментов гена в первичном ассортименте рецептора антигена (Lee et al., 2003). В рамках модели «гистонового кода» избирательность расщепления должна определяться процессом, который транслировал бы уникальные свойства индивидуальных RSS или соседних последовательностей в специфический паттерн модификации гистонов, маркирующий сайт для растепления, осуществляемого RAG. Этот код может быть установлен с помощью антисмысловых транскриптов. Конечно, антисмысловая межгенная транскрипция по всему кластеру гена VH предваряет рекомбинацию VH-DJH локуса IgH в про-В-клетках (Bolland et al., 2004). Эти длинные антисмысловые транскрипты могут направлять ремоделинг хроматина таким образом, чтобы открыть большой домен гена VH перед рекомбинацией. В качестве альтернативы эти антисмысловые транскрипты могли бы сформировать двухцепочечные гибриды РНК с короткими смысловыми транскриптами VH зародышевой линии и затем быть подвергнутыми процессингу с помощью механизма РНК-интерференции, чтобы произвести микроРНК, которые рекрутируют HKMTs к сайтам рекомбинации (Bolland et al., 2004, см. о деталях аппарата RNAi в главе 8). В развитие этой гипотезы мы допускаем, что специфическая смысловая транскрипция определенного сайта RSS зародышевой линии может генерировать двухцепочечную РНК. которая могла бы «нацеливать» ферменты, модифицирующие гистоны, на эту, но не на все другие последовательности RSS. Если это будет подтверждено экспериментально, данный гипотетический механизм мог бы объяснить точность и избирательность расщепления индивидуальных сайтов RSS, осуществляемое RAG. Интересно, что недавно было показано, что белок RAG2 непосредственно взаимодействует с гистонами и может, таким образом, играть важную роль в считывании специфического паттерна модификации гистонов на индивидуальных последовательностях нуклеотидов RSS (West et al., 2005).

3.2. Субъядерное перемещение генов иммуноглобулинов