Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Наличие геномного импринтинга у млекопитающих имеет существенное медицинское, социальное и интеллектуальное значение в плане (1) клиники генетических признаков и заболеваний, (2) возможности контролировать репродукцию человека и животных с помощью вспомогательных репродуктивных технологий и (3) прогресса биотехнологии и постгеномных медицинских исследований. При любом современном обсуждении генетических проблем, будь то исследования или медицина, обязательно необходимо считаться с тем, обнаруживает ли данный ген двуродительский (т. е. диплоидный) характер экспрессии или же подвержен геномному импринтингу и демонстрирует специфичную в отношении родителя (т. е. гаплоидную) экспрессию. Как это ни удивительно, после того как было однозначно показано, что три гена у мышей обнаруживают специфичную в отношении родителя экспрессию, широкого признания существование и значение геномного импринтинга не получили вплоть до начала 1990-х годов, несмотря на его важность для здоровья и благополучия человека.

Однако специфичное в отношении родителя поведение целых хромосом уже наблюдали в цитогенетических исследованиях хромосом у членистоногих еще в 1930-е годы (Chandra and Nanjundiah, 1990). Интересно, что термин «хромосомный импринтинг» впервые был предложен для описания элиминации хромосом отцовского происхождения у некоторых видов артропод (Crouse et al., 1971). Был также замечен хромосомный импринтинг Х-хромосомы млекопитающих, который приводит к инактивации одной из двух Х-хромосом, а именно хромосомы отцовского происхождения, во всех клетках самок сумчатых и в экстраэмбриональных тканях мыши (Cooper et al., 1971). В тот же самый период классические генетики получали у мышей мутантов с хромосомными транслокациями, которые заложили фундамент для наблюдений экспрессии импринтированных генов. Некоторые из этих «транслокационных» мышей, первоначально использовавшихся для картирования генов на хромосомах, демонстрировали специфичный в отношении родителя фенотип, когда определенные хромосомные участки были унаследованы как дупликации хромосомы одного родителя в отсутствие хромосомы другого родителя (что известно как однородительскя дисомия, или UPD, рис. 19.1). Эти результаты указывали на возможность того, «что для нормального развития мыши важна гаплоидная экспрессия определенных материнских или отцовских генов» (Searle and Beechey, 1978) В то же самое время другие генетики использовали необычного мутанта мыши, известного как “Hairpin-tail”, который имел большую делецию хромосомы 17, для того чтобы однозначно опровергнуть основной принцип генетики, согласно которому «организмы, гетерозиготные по данному локусу фенотипически идентичны независимо от того, какая гамета внесла в генотип ту или иную аллель» (Johnson, 1974). Вместо этого потомство, получившее делецию Hairpin-tail от матери, имело увеличенные размеры и погибало в середине эмбрионального развития, тогда как передача генетически идентичной хромосомы от отца давала жизнеспособных и фертильных мышей (рис. 19.1). В ретроспективном плане можно отметить, что несмотря на существование инактивации импринтированной Х-хромосомы у млекопитающих пользовавшаяся наибольшим вниманием трактовка этих экспериментов с генетическими транслокациями и делениями сводилась к тому, что гены на этих аутосомах в гаплоидном яйце или спермии действовали главным образом, чтобы модифицировать белки, используемые позже в эмбриональном развитии.

Рис. 19.1. Модели (мышь) для исследования геномного импринтинга, позволяющие различать материнскую и отцовскую хромосомы

^{Млекопитающие являются диплоидными и наследуют полный хромосомный набор от матери и от отца. Однако можно создать мышей, которые (1) наследуют обе копии хромосомной пары от одного родителя и ни одной от другого (явление, известное как однородительская дисомия, или UPD); (2) наследуют частичную хромосомную делецию от одного родителя и хромосому дикого типа от другого; (3) наследуют хромосомы, несущие однонуклеотидные полиморфизмы (известные как SNPs) от одного родителя и хромосому дикого типа от другого. Потомки с UDPs или делениями склонны обнаруживать летальные фенотипы, тогда как SNPs обычно обеспечивают получение жизнеспособного потомства: (mat) — материнский; (запрещающий знак) — импринт}

Несмотря на это концепция дифференциального функционирования материнского и отцовского геномов обретала почву, и было выдвинуто предположение, что «материнский геном мог бы быть в норме активным в хромосомном участке Hairpin-tail, в то время как его отцовский партнер преимущественно инактивирован» (McLaren, 1979). Важный шаг к установлению существования геномного импринтинга у млекопитающих был сделан несколькими годами позже с разработкой улучшенной технологии ядерных пересадок, с помощью которой тестировалась возможность получения диплоидных однородительских эмбрионов с использованием исключительно ядер из мышиных яйцеклеток. С помощью техники ядерных пересадок донорский мужской или женский пронуклеус извлекали из только что оплодотворенной яйцеклетки и тонкой микропипеткой переносили его внутрь оплодотворенной яйцеклетки хозяина, из которой был предварительно удален материнский или отцовский пронуклеус. Таким путем воссоздавались диплоидные эмбрионы, с той лишь разницей, что они обладали двумя материнскими или двумя отцовскими геномами (известные, соответственно, как гиногенетические и андрогенетические эмбрионы) (рис. 19.2). Эта техника была вначале использована для того, чтобы показать, что ядра от оплодотворенных мутантных эмбрионов Hairpin-tail нельзя было «спасти», пересадив их в хозяйскую яйцеклетку дикого типа. Это доказывало, что именно геном эмбриона, а не цитоплазма ооцита, несет дефект Hairpin-tail. Это также подтверждало предположение о том, что гены на материнской и отцовской копиях хромосомы 17 функционируют по-разному в ходе эмбрионального развития (McGrath and Solter, 1984b). Впоследствии ядерные пересадки были использованы, чтобы продемонстрировать, что эмбрионы, реконструированные из двух материнских пронуклеусов (известные как гиногенетические эмбрионы) или двух отцовских пронуклеусов (андрогенетические эмбрионы), были нежизнеспособными; только эмбрионы, реконструированные из одного материнского и одного отцовского пронуклеуса давали жизнеспособное и фертильное потомство (McGrath and Solter, 1984а; Surani et al., 1984). Эта работа опровергла предшествующее мнение, что однородительские мыши могут развиваться до взрослого состояния (Hoppe and Illmensee, 1982). Гиногинетические эмбрионы в момент гибели были дефектными по экстраэмбриональным тканям, которые входят в состав плаценты, а андрогенетические эмбрионы были дефектными по эмбриональным тканям Это привело к гипотезе о том, что для эмбрионального развития требуются импринтированные гены, экспрессируемые с материнского генома, тогда как отцовский геном экспрессирует импринтированные гены, необходимые для экстраэмбрионального развития (Barton et al., 1984). Последующая идентификация импринтированных генов у мыши не подтвердила такое смещение в функционировании импринтированных генов, показывая, что наблюдаемые различия между гиногенетическими и андрогенетическими эмбрионами можно объяснить доминантным эффектом одного или нескольких импринтированных генов.

Эксперименты с пересадкой ядер, в сочетании с подкрепляющими данными генетики мышей, дали убедительное доказательство того, что для эмбриогенеза у мышей требуются оба родительских генома, и заложили прочный фундамент для существования геномного импринтинга у млекопитающих (рис. 19.2). Широкий обзор вкладов родительских хромосом в эмбриональное развитие с использованием «транслокационных» мышей для создания UPD-хромосом (рис. 19.1) позволили идентифицировать у мыши два участка на хромосомах 2 и 11, которые демонстрировали противоположные фенотипы, когда присутствовали в виде двух материнских либо двух отцовских копий. Это еще более усилило доводы в пользу экспрессии специфичных в отношении родителя генов у млекопитающих (Cattanach and Kirk, 1985).

Рис. 19.2. Для репродукции млекопитающих нужны материнский и отцовский геномы

^{Техника ядерных пересадок использовала микропипетки и микроскопы с большим увеличением для удаления мужского или женского ядра из только что оплодотворенной яйцеклетки и введения их в разных комбинациях во вторую оплодотворенную яйцеклетку («хозяна»), которая уже была денуклеирована; тем самым создавались снова диплоидные эмбрионы с двумя материнскими (гиногенетические) или двумя отцовскими (андрогенетические) геномами или двуродительским геномом (дикий тип). Гиногенетические и андрогенетические эмбрионы были летальными на ранних эмбриональных стадиях. Лишь те реконструированные эмбрионы, которые получили и материнское, и отцовское ядро (дикий тип), выживали и давали живых мышат Эти эксперименты показывают, что при воспроизведении млекопитающих необходимы и материнский, и отцовский геномы и что эти два родительских генома экспрессируют разные наборы генов, нужных для полного эмбрионального развития}

Кроме того, накапливались клинические данные по генетике человека, которые убедительно свидетельствовали о том, что некоторые генетические состояния, в особенности синдром Прадера — Уилли (Prader-Willi), который, по-видимому, возникает исключительно путем передачи от отца, лучше всего объясняются экспрессией генов, специфичных в отношении родителя (Reik, 1989). Дальнейшие ключевые данные были получены в результате применения вновь разработанной технологии получения трансгенных мышей путем микроинъекции генных последовательностей в оплодотворенные яйцеклетки мышей. Этому нередко препятствовала проблема метилирования ДНК, неожиданно вызывающего сайленсинг трансгена в соматических тканях. Эта «проблема», однако, придала вес аргументам в пользу того, что родительские хромосомы ведут себя различно, когда было показано, что некоторые трансгены обнаруживают специфичные в отношении родителя различия по их способности приобретать метилирование ДНК. Обычно трансгены, переданные матерью [matemal-transmitted transgenes], метилировались, тогда как трансгены, переданные отцом, — нет. Однако лишь в нескольких случаях различия в метилировании ДНК коррелировали со специфичной в отношении родителя экспрессией. Хотя позднее было обнаружено, что существуют многочисленные черты сходства между импринтингом метилирования «трансгена» и геномным импринтингом эндогенных генов у мышей, по некоторым признакам они различаются (Reik et al., 1990). К их числу относятся высокая чувствительность к эффектам фона, что в большинстве случаев требует смешанного генетического фона для выявления импринтированного поведения, неспособность поддерживать импринтированную экспрессию в разных сайтах интеграции хромосом и потребность в чужеродных нуклеотидных последовательностях ДНК для производства импринтированного эффекта (Chaillet et al., 1995).

Несмотря на обилие данных в пользу существования геномного импринтинга у млекопитающих его окончательное доказательство зависело от идентификации генов, демонстрирующих специфичную в отношении родителя экспрессию. Это случилось в 1991 году, когда были описаны три импринтированных гена мыши. Первый из них, lgf2r (Insulin-like growth factor type 2 receptor, то есть рецептор-«мусорщик» [«scavenger» receptor] для ростового гормона /g/2), был идентифицирован как матерински экспрессируемый импринтированный ген. Позднее было показано, что этот ген объясняет фенотип чрезмерного роста мутанта Hairpin-tail у мышей (Barlow et al., 1991). Спустя несколько месяцев ген Igf2 (Insulin-like growth factor type 2), о котором было известно, что он функционирует как гормон роста, был идентифицирован как отцовски экспрессируемый импринтированный ген (DeChiara et al., 1991; Ferguson-Smith et al., 1991). Наконец, впоследствии было показано, что ген Н19 (клон № 19 сДНК, выделенный из библиотеки фетальной печени), необычная некодирующая РНК (ncRNA), является матерински экспрессируемым импринтированным геном (Bartolomei et al., 1991). Чтобы идентифицировать эти три импринтированных гена, были использованы разнообразные стратегии, каждая из которых зависела от новых технологий, появляющихся в генетике мыши. Что касается Igf2,r было использовано позиционное клонирование [positional cloning], чтобы идентифицировать гены, которые картировались в делеции Hairpin-tail на хромосоме 17, и мыши, унаследовавшие эту делецию от одного родителя, были использованы для идентификации генов, обнаруживающих матерински-специфичную экспрессию (рис. 19.1). Что касается Igf2, физиологическую роль этого ростового фактора в эмбриональном развитии тестировали методом инсерционного мутагенеза. Удивительно, что мыши, несущие мутантную нефункциональную аллель, демонстрировали характерный фенотип после передачи от отца, но не обнаруживали его после передачи от матери. В свете ранее полученных данных о том. что нуклеотидные последовательности чужеродной ДНК могут индуцировать импринтированную экспрессию мышиных генов, отцовски-специфичную экспрессию Igf2 с немодифицированных хромосом дикого типа удалось подтвердить также, используя мышей, несущих реципрокные родительские дупликации и нехватки в хромосоме 7 (рис. 19.1). ncRNA HI9 была идентифицирована как импринтированный ген в ходе проверки гипотезы о том, что импринтированные гены могут быть собраны в кластеры, после того как этот ген был картирован вблизи локуса Igf2 на хромосоме 7 Хотя все эти стратегии должны были оказаться полезными в последующих попытках идентифицировать импринтированные гены, демонстрация того, что импринтированные гены собраны в плотные кластеры, оказалась центральным открытием для нашего понимания механизма, контролирующего геномный импринтинг у млекопитающих.

2. Геномный импринтинг — эпигенетическая система регуляции генов

Определяющей характеристикой геномного импринтинга является то, что он действует в cis-конфигурации (см. врезку внизу). Таким образом механизм импринтинга действует только на одну хромосому. Это контрастирует с /гая5-действуюишми механизмами регуляции генов, которые могут воздействовать на любую хромосому в ядре. Две родительские хромосомы в норме обычно содержат многочисленные однонуклеотидные различия (известные как однонуклеотидные полиморфизмы, SNPs), если данная популяция является аутбредной, но они могут быть генетически идентичны, если используются инбредные линии мышей. Поскольку геномный импринтинг наблюдается у инбредных мышей, имеющих идентичные родительские хромосомы, этот процесс должен использовать некий эпигенетический механизм, чтобы модифицировать информацию, содержащуюся в нуклеотидной последовательности ДНК и создать различие в экспрессии между двумя родительскими копиями гена. Эти наблюдения показывают также, что работает cis-действующий механизм сайленсинга, который ограничен одной хромосомой, так что факторы сайленсинга не могут свободно диффундировать в ядре и достигать активную копию гена. Хотя импринтированные гены репрессированы на одной родительской хромосоме и активны на другой, мы не знаем a priori, что геномный импринтинг — это только механизм сайленсинга. Наоборот, мы должны также иметь в виду, что он может быть неким активирующим механизмом, направленным на ген, который «по умолчанию» является сайленсированным в геноме млекопитающих.

Стартовая точка для геномного импринтинга должна, следовательно, зависеть от эпигенетической системы, которая модифицирует, или «импринтирует» одну из двух родительских хромосом (рис. 19.3). Мы можем приводить доводы в пользу того, что этот импринт впоследствии используется для привлечения или отталкивания транскрипционных факторов и, таким образом, для изменения экспрессии импринтированного гена на одной родительской хромосоме. Поскольку мы знаем, что инбредные мыши с генетически идентичными хромосомами также обнаруживают геномный импринтинг, мы можем говорить, что родительские импринты не могут быть приобретены после того, как эмбрион становится диплоидным, потому что у эпигенетической машинерии клетки не было бы способа различить идентичные родительские копии генов. Таким образом, родительские импринты должны быть приобретены, когда два родительских хромосомных набора разделены, а это имеет место только во время формирования гамет и в течение примерно 12 часов после оплодотворения (рис. 19.3). Наиболее вероятный сценарий заключается в том, что гаметические импринты накладываются на отцовски-импринтированные гены во время образования спермиев и на матерински-импринтированные гены во время формирования яйцеклетки. Ключевая особенность «импринтированой» последовательности ДНК заключается в том, чтобы она была бы модифицирована только в одной из двух родительских гамет; таким образом, требуются системы узнавания двух типов, одна спермий-специфичная, а другая ооцит-специфичная, и каждая была бы направлена на другую нуклеотидную последовательность ДНК. Для импринта требуются еще несколько особенностей. Во-первых, будучи однажды установлен, он должен оставаться на той же самой родительской хромосоме после оплодотворения, когда эмбрион становится диплоидным. Во-вторых, этот импринт должен наследоваться той же родительской хромосомой после каждого клеточного деления у эмбриона и взрослого животного. Наконец, он должен «стираться». Последнее необходимо, потому что эмбрион примерно с середины своего развития последует либо по мужскому, либо по женскому пути развития, и его гонадам нужно будет производить только один тип импринтированных гаплоидных родительских гамет. Поскольку зародышевые клетки возникают из эмбриональных диплоидных клеток (рис. 19.3), они должны сперва потерять унаследованные ими материнские и отцовские импринты, прежде чем они приобретут импринты гамет.

Ключевые особенности геномного импринтинга у млекопитающих

¦ cis-действуютий механизм

¦ Результат особенностей наследования, а не пола.

¦ Импринты являются эпигенетическими модификациями, приобретаемыми одной родительской гаметой

¦ Импринтированные гены в основном собраны в кластеры вместе с некодирующей РНК.

¦ Импринты могут модифицировать удаленные регуляторные элементы, которые действуют на множественные гены.

¦ Импринтированные гены играют роль в развитии млекопитающих

Рис. 19.3. Приобретение и стирание импринтов в ходе развития млекопитающих

^{Импринты приобретаются гаметами; таким образом, ооциты и спермин уже несут импринтированные хромосомы (импринты 1-й генерации). После оплодотворения, когда эмбрион становится диплоидным, данный импринт поддерживается на той же самой родительской хромосоме после каждого клеточного деления в клетках эмбриона, оболочках, плаценте, а также у взрослого животного. Зародышевые клетки формируются в эмбриональной гонаде, и импринты стираются только в этих клетках до детерминации пола. Коль скоро эмбрион развивается в самца, гонады дифференцируются в семенники, продуцирующие гаплоидные сперматозоиды, которые приобретают отцовский импринт на своих хромосомах. Аналогичным образом, у развивающихся самок хромосомы в яичниках приобретают материнские импринты (импринты 2-й генерации)}

Каким образом идентифицируются гаметические импринты? Не слишком вдаваясь в семантику, импринт можно определить как эпигенетическую модификацию, отличающую материнскую копию гена от отцовской копии гена Импринт, будучи однажды сформирован, должен также позволять транскрипционной машине по-разному обрабатывать материнскую и отцовскую копии гена, находящиеся в одном и том же ядре. Можно предсказать, что гаметический импринт будет непрерывно присутствовать на всех стадиях развития (рис. 19.3); таким образом, импринты можно обнаружить, сравнивая эпигенетические модификации на материнских и отцовских хромосомах в эмбриональных или взрослых тканях (с использованием стратегий, изображенных на рис. 19.1) и прослеживая их в развитии обратно, до одной из двух гамет. Гаметические импринты могли бы быть модификациями ДНК или гистоновых белков, которые упаковывают ДНК в хромосомы. Хотя у млекопитающих известен лишь один тип эпигенетических модификаций ДНК, а именно метилирование ДНК (глава 18), гистоны могут нести множественные типы модификаций, в том числе метилирование, ацетилирование, фосфорилирование. сумоилирование и убиквитилирование (дополнительные детали см. в главе 10). Они могут также замещаться вариантными гистонами со специфическими функциями (главы 3 и 13). Любые из этих эпигенетических модификаций можно было бы теоретически квалифицировать как импринт. Мы можем считать, что ферменты, ответственные за эти эпигенетические модификации, могли бы экспрессироваться в одной из двух гамет и специфически ассоциироваться с одной родительской хромосомой, чтобы скопировать данную модификацию, когда клетка делится. Однако, как описывается в разделе 3, лишь метилирование ДНК было четко продемонстрировано в качестве гаметического импринта для импринтированных генов у млекопитающих и, на сегодняшний день, является единственной наследуемой модификацией.

Каким образом действует гаметический импринт, чтобы контролировать импринтированную экспрессию? Как обсуждалось выше, нам необходимо «быть открытыми» в вопросе о том, ведет ли импринт к активации или же к репрессии одной родительской копии импринтированного гена. Чтобы понять, как действует импринт, нам нужна информация по трем вопросам: какая родительская хромосома несет данный импринт, какая родительская хромосома несет экспрессируемую аллель импринтированного гена и каково положение импринтированной последовательности по отношению к экспрессируемой или «молчащей» аллели импринтированного гена. Используя подходы этого типа, мы теперь знаем, что гаметические импринты могут действовать на целые кластеры генов сразу. Эти импринтированные кластеры содержат от 3 до 10 импринтированных генов и имеют протяженность от 100 т. п.н. до 3000 т. п.н. геномной ДНК (дополнительные детали см. http://www.mgu.har.mrc.ас.uk/research/imprinting/). Большинство генов в любом одном кластере — это импринтированные гены иРНК, кодирующих белки; однако по меньшей мере один из них — всегда ген импринтированной ncRNA (некодирующей РНК).

Из-за расположения импринтированных генов в виде кластеров, при том что некоторые гены экспрессируются с одной родительской хромосомы, а некоторые с другой, не всегда просто определить, как действует импринт. Можно исследовать влияние импринта на единичные гены в кластере, но может оказаться более информативным изучать влияние импринта на весь кластер. Более детально это описывается в разделе 3. Одно, тем не менее, очевидно. Природа не выбрала самую простую модель, по которой импринт направляется к промотору, чтобы преимущественно [preemptively] сайленсировать импринтированный ген в одной гамете. Вместо этого оказывается, что импринты, в целом, направляются к удаленным cis-действующим репрессорам, которые влияют на экспрессию множественных генов, локализованных на больших расстояниях на той же хромосоме.

3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга

3.1. Импринтированные гены контролируют эмбриональный и неонатальный рост