Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 5.3. Гетерохроматин упакован в регулярный нуклеосомный порядок

^{Мобильный элемент (а), несущий маркированную копию гена теплового шока для исследования и hsp70-управляемую копию white в качестве визуального маркера, можно использовать для изучения одного и того же гена в разных хроматиновых доменах. Ядра эмбрионов Drosophila из линии, несущей этот трансген в эухроматиновом домене (39С-Х; красные глаза), и из линии, несущей тот же самый трансген в гетерохроматиновом домене (HS-2; мозаичный глаз), были переварены возрастающими количествами фермента MNase, ДНК очистили и разогнали в агарозном геле, а Саузерн-блот гибридизировали с зондом, уникальным для трансгена (б). Линкерные сайты, расщепленные MNase, отмечены стрелками, (в) Сравниваются денситограммы последней дорожки каждой пробы (сверху вниз — слева направо). В гетерохроматине можно видеть набор 9—10 нуклеосом (красная линия) по сравнению с 5—6 нуклеосомами в эухроматине (синяя линия), что показывает наличие более регулярного «шага» в первом случае, (г) Схематическое представление этих результатов (б, в — с любезного разрешения из Sun et al., 2001, с изменениями [©American Society for Microbiology])}

Мутации Su(var) и E(var) идентифицируют гены, причинно связанные с началом сайленсинга гетерохроматиновых генов при PEV [with the onset of hetero-chromatic gene silencing in PEV]. Молекулярный анализ этих генов сыграл существенную роль в углублении понимания механизмов, приводящих к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов. В большинстве случаев модифицирующее влияние мутаций на PEV является доминантным, и гетерозиготы Su(var)/+ или E(var)/+ демонстрируют фенотип с подавленным или усиленным PEV (рис. 5.1). Эффективное выделение и детальный генетический анализ мутаций Su(var) и E(var) зависят от наличия подходящей для эксперимента PEV-перестройки. Хотя было описано большое число PEV-перестроек (Flybase, 2005), лишь немногими из них можно легко воспользоваться для эффективного генетического скрининга и изоляции доминантных мутаций-модификаторов. Одна из наиболее полезных для такой экспериментальной работы PEV-перестроек— In(1)wm4 (Muller 1930). Эта перестройка обусловливает мозаицизм по white — фенотип, легко различимый на глазах взрослых мух, как показано на рис.5.1. Пенетрантность мозаицизма по white у wm4 является 100 %-ной, так что каждая муха в исходном штамме [the starting stock] имеет глаза с белой пятнистостью. Инактивация гена white не влияет на жизнеспособность или фертильность, что обусловливает возможность неограниченной работы с мухами, гомозиготными по wm4.

В перестройке wm4 ген white в результате инверсии оказывается в непосредственной близости с гетерохроматиновым материалом Х-хромосомы, локализованным на дистальной границе ядрышкового организатора (Cooper, 1959). Этот район содержит тандемные порядки мобильных элементов типа R1; гетерохроматиновая точка разрыва In(1)wm4 находится внутри единицы повтора R1 (A. Ebert and G. Reuter, неопубликовано). После воздействия Х-лучами или EMS (этанметилсульфонат, химический мутаген) были изолированы ревертанты wm4, имеющие фенотип w+ (Tartof et al., 1984; Reuter et al., 1985). Анализ более 50 ревертантных хромосом w+ (все они обнаружили реинверсию или транслокацию гена white в соседство с эухроматином) позволил предположить, что гетерохроматиновый материал, фланкирующий непосредственно точку разрыва, вызывает инактивацию гена white у wm4. Большинство ревертантов снова обнаруживают белую пятнистость, если вводятся сильные мутации E(var), что заставляет предполагать, что некоторые гетерохроматиновые последовательности после перемещения остаются ассоциированными с геном white. Эти исследования позволяют считать повторяющуюся ДНК (в данном случае повторы R1) мишенью для формирования гетерохроматина.

Большинство известных мутаций-модификаторов PEV были изолированы с использованием сенсибилизированного генетического фона. Для изоляции доминантных супрессорных мутаций тест-генотип содержит доминантный энхансер, тогда как в схемах для изоляции энхансерных мутаций используется доминантный супрессор (Dorn et al., 1993b). Если тест-генотип содержит энхансер мозаичности, все мухи wт4 имеют белые глаза, и исключения, имеющие пятнистые или красные глаза, указывают на вновь индуцированные мутации Su(var). Соответственно, в тест-линии с доминантным супрессором все мухи wт4 имеют красные глаза, а исключительные мухи с мозаичным фенотипом указывают на вновь индуцированные мутации E(var). Эти сенсибилизированные генетические схемы благоприятствуют изоляции сильно доминантных мутаций Su(var) и E(var), которые оказались очень полезными для детального генетического анализа.

С использованием этого подхода в разных опытах по скринингу просмотрели более миллиона мух, и были изолированы более 140 мутаций Su(var) и 230 мутаций

E(var) (Schotta et al., 2003). Мутации были индуцированы EMS, Х-лучами или ремобилизацией элементов Р. Еще один набор мутаций Su(var) был изолирован в ходе прямого скрининга с wm4 (Sinclair et al., 1983). Скрининг с хромосомой Df(l'J), демонстрирующей сильный мозаицизм по гену yellow (маркер, желтая окраска тела), привел к изоляции 70 мутаций-модификаторов PEV (Donaldson et al., 2002). Кроме того, скрининг на доминантные модификаторы экспрессии транспозонного репортерного гена позволил идентифицировать несколько мутаций с эффектом Su(var) (Birchler et al., 1994). Известно, что выборка критических регуляторных генов даун — регулируется генами группы Polycomb (PcG) и ап — регулируется генами группы trithorax (trxG). В прямых тестах относительно немногие мутации в генах PcG модифицируют PEV (например, Sinclair et al., 1998). Напротив, многие мутации в генах trxG являются энхансерами PEV (Dorn et al., 1993а; Farkas et al., 1994).

В совокупности этот скрининг позволил идентифицировать большое число доминантных мутаций Su(var) и E(var). По данным выполненного к настоящему времени генетического анализа общее число мутаций Su(var) и E(var) можно оценить как приблизительно 150. Большое число генов Su(var) и E(var) с почти идентичными фенотипическими эффектами иногда приводит к несоответствиям в генетической номенклатуре. Чаще всего символы генов Su(var) и E(var) комбинируются с цифрами, указывающими хромосому, в которой локализована данная мутация, с номером гена и номером аллели Так, Su(var)3-917 символизирует аллель 17 девятого гена Su(var), идентифицированного в третьей хромосоме. В настоящее время были тщательно картированы лишь около 30 соответствующих генов и идентифицированы соответствующие аллели (табл. 5.1). Зависящие от дозы эффекты наблюдались для примерно одной трети идентифицированных генов, с использованием серии перекрывающихся нехваток и дупликаций. В этих случаях уменьшение количества генных продуктов из-за утери одной копии гена неизменно приводит к модификации мозаичного фенотипа. Делеции этих локусов Su(var) или E(var) супрессируют или, соответственно, усиливают сайленсинг генов. Исследования с использованием дупликаций позволили идентифицировать новые локусы-модификаторы, которые обнаруживают противоположное (антиподное) влияние на PEV, если путем дупликации или с помощью инсерции трансгена вводится лишняя копия данного гена. Общее число генов-модификаторов PEV, обнаруживающих зависящие от дозы эффекты, оценивается примерно в 15—20 (Schotta et al., 2003).

Если утрата одной копии гена приводит к супрессии PEV, а присутствие трех копий гена ведет к усилению PEV, это позволяет предполагать, что для установления гетерохроматина требуется, в стоихиометрических количествах, продукт, кодируемый этим геном, с сопутствующим сайленсингом гена (рис. 5.2). Были детально охарактеризованы три таких локуса, Su(var)2-5 (кодирующий НР1), Su(var)3-7 (кодирующий белок типа «цинковых пальцев») и Su(var)3-9 (кодирующий метилтрансферазу лизина гистонов). Su(var)2-5 был клонирован путем скрининга библиотеки экспрессии кДНК с помощью моноклонального антитела, распознающего гетерохроматин (James and Elgin, 1986). Кодируемый белок, ассоциированный с гетерохроматином, был впоследствии обозначен НР1 (белок гетерохроматина 1). Гибридизация in situ с использованием выделенной клонированной ДНК позволила идентифицировать ген в районе 28—29 политенных хромосом,

^{См. оригинальное цитирование во Flybase.}

где ранее был картирован Su(var)2-5- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК мутантных аллелей подтвердил, что локус Su(var)2-5 в положении 28F1-2 на хромосоме кодирует HP 1 (Eissenberg et al., 1990), HP1 содержит два консервативных домена, аминотерминальный хромодомен и карбокситерминальный домен «chromoshadow» (Paro and Hogness, 1991), и взаимодействует с несколькими другими хромосомными белками. Su(var)3- 7 был сперва цитогенетически картирован (с помощью серии перекрывающихся делеций и дупликаций) в районе 87Е1-4 в третьей хромосоме. Этот район был проанализирован на уровне ДНК как часть первой «прогулки по хромосоме» [chromosomal walk], выполненной у Drosophila (Bender et al., 1983). С помощью серии перекрывающихся геномных клонов Su(var)3-7был определен в пределах фрагмента ДНК величиной 7.8 т.о., который обладал трипло-энхансерным влиянием на репортер, обнаруживающий мозаичность (Reuter et al., 1990). Su(var)3-7кодирует белок с семью регулярно расположенными [regularly spaced] «цинковыми пальцами» — доменами, которые, как было показано, функционируют в связывании с ДНК (Cleard and Spierer, 2001). Su(var)3-9 был клонирован с помощью таггирования транспозоном P-элементом (Tschiersch et al., 1994). Ген Su(var)3-9 у Drosophila (и у всех других голометаболических насекомых, изученных к настоящему времени) образует бицистронную единицу с геном, кодирующим eIF2y (Krauss and Reuter, 2000). Поскольку транскрипционная единица Su(var)3-9 не имеет интронов, вполне вероятно, что Su(var)3-9 был вставлен в интрон гена eIF2y путем ретротранспозиции. Белок SU(VAR)3-9 содержит хромодомен в своем аминотерминальном участке и домен SET (идентифицированный впервые в белках SU(VAR)3-9, ENHANCER OF ZESTE [E(Z)] и TRITHORAX) (Jones and Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994) на своем карбоксильном конце. Этот белок является метилтрансферазой гистонов, специфически модифицирующей гистон H3 по лизину 9.

Были описаны семь разных мутантных аллелей Su(var)2-5, в том числе миссенс-мутации в хромодомене, преждевременные стоп-кодоны и ошибки сплайсинга (Eisenberg et al., 1992). Мутации Su(var)3-7 были получены с помощью гомологичной рекомбинации (Seum et al., 2002); дополнительные аллели были выявлены как супрессоры сайленсинга, зависимого от P-элемента (Bush-еу and Locke, 2004). Сорок мутантных аллелей Su(var)3-9 были выявлены и определены на молекулярном уровне (Ebert et al., 2004). Иммуноцитологический анализ с использованием специфических антител или химерных белков слияния, экспрессируемых трансгеном [transgene-expressed fusion proteins], показал, что все три белка преимущественно ассоциированы с гетерохроматином (см. ниже и рис. 5.4) (James et al., 1989; Cleard et al., 1997; Schotta et al., 2002). Сильная колокализация особенно очевидна для НР1 и SU(VAR)3-9. Эти белки также связываются с теломерами и в ряде эухроматиновых сайтов (Fanti et al., 1998; Schotta et al., 2002).

Несколько инсерций P-элемента, несущих репортерный ген w+ в теломерные районы, обнаруживают белую пятнистость. Этот феномен называется теломерным эффектом положения (ТРЕ). Упаковка, подобная гетерохроматину, наблюдается в ассоциированных с теломерами сателлитных последовательностях (TAS), кластерах повторяющейся ДНК, расположенных проксимально по отношению к ретровирусным элементам НеТ-А и TART, составляющим теломеры Drosophila (Cryderman et al., 1999a). В целом, не было обнаружено модификации ТРЕ мутациями в известных генах-модификаторах, хотя НР1 важен для целостности теломер. В клетках с недостаточностью по этому белку хромосомы часто сливаются в области своих теломер (Fanti et al., 1998). У Drosophila в ходе недавнего скрининга не было обнаружено никаких /гая5-действуюших доминантных модификаторов ТРЕ (Mason et al., 2004), что заставляет предполагать, что эти участки сайленсированы двумя (или несколькими) независимыми механизмами.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволило идентифицировать белки, специфически ассоциированные с гетерохроматином

Одним из преимуществ работы с Drosophila является возможность изучения политенных хромосом, дающая визуальную «дорожную карту» генома. На стадии личинки хромосомы во многих терминально дифференцированных клетках реплицируются, но не проходят через митоз; нити хроматина остаются спаренными, в состоянии совершенного синапсиса, и все копии выравнены друг с другом. Наиболее крайний случай имеет место в слюнных железах, где эухроматиновые плечи хромосом претерпели 10 раундов репликации, дав в результате около 1000 копий. Однако репликация не является однородной; многие повторяющиеся последовательности недореплицируются, а сателлитные последовательности ДНК не реплицируются вовсе Все хромосомные плечи сливаются в общем хромоцентре. Таким образом, у D. melanogaster наблюдаются пять длинных плечей (X, второе левое [2L], второе правое [2R], третье левое [3L], третье правое [3R]) и короткое плечо четвертой хромосомы, выступающее из конденсированного хромоцентра, состоящего из перицентромерного гетерохроматина (рис. 5.4а) (обзор см. Ashburner et al., 2005)

Хотя генетический анализ позволил идентифицировать многие локусы, необходимые для формирования гетерохроматина, сам по себе он не позволяет определить, играет ли продукт данного локуса прямую или же косвенную роль. Специфическая ассоциация белка с гетерохроматином первоначально наблюдалась при скрининге моноклональных антител (полученных с использованием прочно-связывающихся ядерных белков, где анализировали паттерны распределения на политенных хромосомах. Антитела, специфичные к белку 22 кДа, впоследствии обозначенному как НР1, давали иммунофлуоресцентное «окрашивание» перицентромерного гетерохроматина, теломер и бэндированной [banded] части маленькой четвертой хромосомы, т.е. известных сайтов гетерохроматина (рис. 5.4а) (James and Elgin, 1986). Последующий анализ (описанный выше) показал, что белок НР1 кодируется Su(var)2-5, известным супрессором PEV (Eissenberg et al., 1990). Изучение хромосомной локализации специфическими антителами с использованием либо митотических хромосом (Fanti and Pimpinelli, 2004), либо политенных хромосом (обеспечивающих большее разрешение, но недостаточных по центромерному гетерохроматину) (Silver and Elgin 1976) остается наилучшим способом демонстрации того, что продукт локуса Su(var) кодирует хромосомный белок. Были идентифицированы приблизительно 10 таких специфичных для гетерохроматина белков; если есть мутации в генах, кодирующих эти белки, часто наблюдают доминантную супрессию PEV (см. табл. 5.1) (Ashburner et al., 2005b). Эти белки, в том числе недавно идентифицированный НР2 (рис. 5.4а) (Shaffer et al., 2002), являются кандидатами на роль структурных компонентов гетерохроматина.

Рис. 5.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенныххромосом позволяет идентифицировать белки, преимущественно ассоциированные с гетерохроматином

^{(а) Политенные хромосомы, на фиксированных и давленых препаратах слюнных желез (микроскопия с фазовым контрастом, слева) «окрашены» с помощью инкубирования сначала с антителами, специфичными к данному хромосомному белку, а затем со вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой. НР1 (справа) и НР2 (в центре) имеют сходный рисунок распределения, демонстрирующий бросающуюся в глаза связь с перицентромерным гетерохроматином, маленькой четвертой хромосомой (врезка, стрелка) и небольшой группой сайтов в эухроматиновых плечах. Обратите внимание на то, что на эффективность любого антитела может влиять выбор протокола фиксации (см. Stephens et al. 2003). (б, в) Ассоциация НР1 и SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой. Мутации в Su(var)3-9 приводят к потере НР1 из перицентромерного гетерохроматина (но не четвертой хромосомы; см. текст) (б), тогда как мутации в Su(var)2-5 приводят к делокализации SU(VAR)3-9 (в) (из: Shatter et al. 2002, с изменениями)}

4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина

Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать ключевую функцию, необходимую для сайленсинга гетерохроматиновых генов (Tschiersch et al., 1994). Этот белок содержит домен SET, функционирующий как фермент в метилировании H3K9 гистонов. То, что этот белок является метилтрансферазой лизина гистонов (HKMT), «нацеленной» на H3K9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 (Rea et al., 2000). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной HKMT H3K9 (Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование H3K9в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование H3K9, которое у Drosophila наблюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Ebert et al., 2004). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования H3K9 в сайленсинге гетерохроматиновых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV (обсуждается выше), атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их HKMT Ферментативно гиперактивная мутация Su(var)3-9 pth является сильным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание H3K9me2 и H3K9me3 в хромоцентре, а также порождает заметные сигналы H3K9me2 во многих эухроматиновых сайтах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метальной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5, являются доминантными супрессорами PEV (Larsson et al., 1996).

Исследования с использованием генов Su(var) начали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохроматиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гетерохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов (Schotta et al., 2002). Как контролируется SU(VAR)3-9 — все еще неизвестно. Метилирование H3K9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1. Хромодомен НР1 специфически связывается с H3K9me2 и H3K9me3 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией (Schotta et al., 2002). Район SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену взаимодействует с доменом «chromoshadow» НР1. Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7. SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с доменом «chromoshadow» НР1 (Delattre et al., 2000). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка — НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 — физически связаны в мультимерных белковых комплексах гетерохроматина.

Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой (Schotta et al., 2002). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование H3K9, который специфически узнается хромодоменом НР1 (Bannister etal., 2001; Lachner etal., 2001). Следовательно, у личинок нуль-Su(var)3-9 связывание НР1 с перицентромерным гетерохроматином нарушено (см. рис. 5.4Ь). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с H3K9me2, но не с H3K9me1; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование (Ebert et al., 2004). Диметилирование H3K9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 связывается с этими сайтами, но, по-видимому, неактивен; неизвестная HKMT контролирует метилирование H3K9 в этих районах.

Напротив, если НР1 не присутствует (устранен мутациями), SU(VAR)3-9 больше не связывается с пери-центромерным гетерохроматином, но обнаруживается также по длине эухроматиновых хромосомных плечей (рис. 5.46). Теперь он виден почти во всех бэндах, где он вызывает эктопическое моно- и диметилирование H3K9 (H3K9me1 и H3K9me2) (рис. 5.5). Таким образом, НР1 существен для ограниченного связывания SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином. Эти данные позволяют представить себе последовательность реакций, начинающуюся со связывания SU(VAR)3-9 с гетерохроматиновыми доменами и последующего образования H3K9me2. Эта метка распознается хромодоменом НР1; связывание SU(VAR)3-9 с доменом «chromoshadow» белка НР1 обеспечивает его ассоциацию с гетерохроматином. Был создан химерный белок НР1-РС, в котором хромодомен НР1 был заменен хромодоменом белка Polycomb (PC) (Platero et al., 1996). Хромодомен PC прочно связывается с H3K27me3 (Fischle et al., 2003). Химерный белок HP1-PC узнает, следовательно, сайты связывания H3K27me3 Polycomb в эухроматиновых плечах; в присутствии такого химерного белка НР1-РС белок SU(VAR)3-9 также обнаруживается в сайтах связывания PC, демонстрируя свою сильную связь с доменом «chromoshadow» белка НР1 (Schotta et al., 2002).

В клетках нуль-SU(VAR)3-9 сильно уменьшено содержание еще одной гетерохроматин-специфичной метки метилирования — триметилирования H4K20 (H4K20me3) (Schotta et al., 2004). Было показано, что взаимозависимость между диметилированием H3K9 и триметилированием H4K20 отражает взаимодействие между белками SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20. SUV4-20 является HKMT, контролирующей метилирование H4K20 в гетерохроматине. Это гетерохроматин-специфичная метка метилирования сильно ослаблена в нуль-клетках по SU(VAR)3-9, как и по НР1, заставляя предполагать ассоциацию SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20 в комплекс взаимно зависимых белков. Мутации в гене Suv4-20 вызывают сильную супрессию индуцированного PEV сайленсинга генов, показывая, что для этого процесса требуется метка H4K20me3.

Рис. 5.5. Взаимодействие SU(VAR)3-9 и НР1 в установлении паттерна распределения H3K9me

^{(a) SU(VAR)3-9 отвечает за деметилирование НЗК9 (H3K9me2); утрата энзима приводит к утрате этой модификации в перицентромерном гетерохроматине, как показывает утрата окрашивания антителами политенных хромосом (сравни среднюю панель с верхней панелью). Утрата НР1 приводит к утрате «нацеливания» SU(VAR)3-9; высокие уровни H3K9me2 видны теперь на всех хромосомных плечах (нижняя панель), (б) YH1 взаимодействует с H3K9me2 через свой хромодомен, а с SU(VAR)3-9 — через домен «chromoshadow». Узнавая и модификацию гистонов, и фермент, отвечающий за эту модификацию, НР1 обеспечивает механизм распространения гетерохроматина и эпигенетического наследования}