Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Strahl-Bolsinger S., Hecht A., Luo K., and Grunstein M. 1997. SIR2 and SIR4 interactions differ in core and extended telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev. 11: 83-93.

Suka N., Luo K., and Grunstein M. 2002. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine 16 and spreading of heterochromatin. Nat. Genet. 3: 378-383.

Suka N., Suka Y., Carmen A.A., Wu J., and Grunstein M. 2001. Highly specific antibodies determine histone acetylation site usage in yeast heterochromatin and euchromatin. Mol. Cell 8: 473-479.

Taddei A., Hediger E, Neumann F.R., Bauer C, and Gasser S.M. 2004. Separation of silencing from perinuclear anchoring functions in yeast Ku80 Sir4 and Esc1 proteins. EMBO J. 23: 1301-1312.

Tanner K.G., Landry J., Stemglanz R., and Denu J.M. 2000. Silent information regulator 2 family of NAD-dependent histone/ protein deacetylases generates a unique product, 1-O-acetyl-ADP-ribose. Proc. Natl Acad. Set. 97: 14178-14182.

Thompson J.S., Johnson L.M., and Gmnstein M. 1994. Specific repression of the yeast silent mating locus HMR by an adjacent telomere. Mol. Cell. Biol. 14: 446-455.

van Leeuwen R, Gafken PR., and Gottschling D.E. 2002. Dotlp modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core. Cell 109: 745-756.

Weiss K. and Simpson R.T. 1998. High-resolution stmctural analysis of chromatin at specific loci: S. cerevisiae silent mating type locus HMLa. Mol Cell. Biol. 18: 5392-5403.

Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila

Sarah C.R. Elgin¹ и Gunter Reuter²

1Department of Bilogy, Washington University, St. Louis, Missouri 63130

2Institute of Genetics, Biologicum, Martin Luther University Halle, D-06120 Halle, Germany

Общее резюме

Гены, оказавшиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином в результате либо перестройки, либо транспозиции [transposition], обнаруживают мозаичный фенотип, показывая тем самым, что данный ген оказался сайленсированным в некоторых клетках, в которых в норме он активен (эффект положения мозаичного типа — PEV, position-effect variegation). Сайленсинг, происходящий при PEV, можно приписать упаковке репортерного гена в гетерохроматиновой форме; это показывает, что формирование гетерохроматина, будучи однажды инициировано, может распространяться и охватывать близлежащие гены. На Drosophila melanogaster возможен генетический, цитологический и биохимический анализ, и в этой главе мы показываем, как эти разные подходы в совокупности помогли идентифицировать многих потенциальных участников этой системы, позволив в результате охарактеризовать несколько белков, играющих ключевую роль в установлении и поддержании гетерохроматина. Формирование гетерохроматина решающим образом зависит от метилирования гистона H3 по лизину 9, с сопутствующей ассоциацией Белка Гетерохроматина 1 (НР1 — Heterochromatin Protein 1) и других взаимодействующих белков, в том числе H3K9-метилтрансфераз; множественные взаимодействия этих белков необходимы для поддержания и распространения гетерохроматина. «Нацеливание» на гетерохроматин, в том числе накопление H3K9ше, происходит, по-видимому, с участием машинерии РНК-интерференции (RNAi), хотя играют роль и специфические ДНК-белковые взаимодействия. Хотя гетерохроматиновые районы (перицентромерные районы, теломеры и маленькая четвертая хромосома) обладают общей биохимией, каждый из них отличается от других, а перицентромерные районы мозаичны. Гетерохроматин у Drosophila беден генами, но не лишен их вовсе, и гены, находящиеся в гетерохроматине, зависят в своей экспрессии от этой среды. Окончательная модель формирования и поддержания гетерохроматина (включая «нацеливание» и распространение) должна будет принять в расчет различные реакции разных генов на это хроматиновое окружение.

1. Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный фенотип

Большие сегменты эукариотического генома, в основном повторяющиеся последовательности, упакованы в постоянно неактивной форме как конститутивный гетерохроматин. Эта фракция хроматина была исходно идентифицирована как та часть генома, которая остается конденсированной и интенсивно окрашивающейся (гетеропикнотической), по мере того, как клетка переходит от метафазы к интерфазе; такой материал обычно ассоциирован с теломерами и перицентромерными районами хромосом. Гетерохроматиновые районы обнаруживают тенденцию к поздней репликации и демонстрируют лишь незначительную мейотическую рекомбинацию или даже вовсе никакой. Эти районы бедны генами, но не лишены их вовсе, и те гены, которые там есть, для своей оптимальной экспрессии часто зависят от этой среды. Около одной трети генома Drosophila считается гетерохроматиновой, включая целую Y-хромосому, большую часть маленькой четвертой хромосомы, перицентромерные 40 % Х-хромосомы и перицентромерные 20 % больших аутосом. На протяжении нескольких последних десятилетий мы узнали очень многое о биохимии гетерохроматина, и многие из этих сведений получены в наших исследованиях, проведенных на Drosophila (Richards and Elgin, 2002; Schotta et al., 2003).

Одной из первых мутаций, идентифицированных у D. melanogaster, была мутация white — мутация, результатом которой оказывается белая окраска глаз мухи, а не характерная для них красная пигментация. Используя Х-лучи в качестве мутагена, Меллер (Muller, 1930) наблюдал необычный фенотип, при котором глаз был мозаичным, с участками красных и участками белых фасеток (рис. 5.1). Этот фенотип заставлял думать, что сам ген white не поврежден — в конце концов, некоторые фасетки оставались красными, и даже можно было получить мух-ревертантов с полностью красными глазами, вновь используя Х-лучи как мутаген. Однако ген white был несомненно сайленсирован в некоторых клетках, в которых он экспрессируется в норме Последующие исследования политенных хромосом (представлены ниже, см. рис. 5.4) показали, что такие фенотипы были следствием инверсии или перестройки, когда одна точка разрыва находилась в пределах перицентромерного гетерохроматина, а другая — вблизи гена white (см. рис. 5.1). Поскольку причина такого мозаичного фенотипа — в изменении положения гена в пределах хромосомы, это явление называется эффектом положения мозаичного типа (PEV) У Drosophila было показано, что по существу каждый ген, который был изучен в соответствующей перестройке, проявляет мозаипизм, и перестройки, включающие перицентромерный гетерохроматин любой хромосомы, могут приводить к PEV. PEV наблюдали у ряда организмов, в том числе у дрожжей, мух и млекопитающих, но как инструмент для изучения формирования гетерохроматина он был использован в основном у Drosophila.

Рис. 5.1. Схематическое изображение мозаичности white в инверсии In(1)wm4 в Х-хромосоме

^{Локус white, в норме расположенный в дистальном эухроматине (синий цвет), теперь помещен в пределах 25 т.о. от точки разрыва в перицентромерном гетерохроматине (розовый цвет) Х-хромосомы благодаря индуцированной Х-лучами инверсии. Распространение гетерохроматиновой упаковки в эухроматиновый район приводит к сайленсингу; утрата сайленсинга в некоторых клетках в ходе дифференцировки дает мозаичный фенотип. Используя мух, обнаруживающих PEV, можно отселектировать мутации во втором сайте, которые либо супрессируют этот фенотип (мутации Su(var); приводят к утрате сайленсинга), либо усиливают фенотип (мутации Е(var); вызывают усиление сайленсинга)}

PEV показывает, что такие перестройки позволяют упаковке в гетерохроматиновую конфигурацию «распространяться» вдоль по длине хромосомы. Все выглядит таким образом, как если бы перестройка удалила существующий в норме барьер или буферную зону. Следствием этого является измененная упаковка и сайленсинг генов, в норме организованных в эухроматиновой форме. Визуальное обследование политенных хромосом личинок, несущих такую перестройку, показывает, что район, несущий репортерный ген, упакован теперь в плотный блок гетерохроматина, но только в тех клетках, в которых этот ген неактивен (Zhimulev et al., 1986). Картина, наблюдаемая вследствие перестройки white, может варьировать по числу пигментированных клеток, величине пигментированных пятен и уровню содержания пигмента в наблюдаемых двух разных клеточных типах (рис. 5.1). В системе, использующей в качестве репортера индуцибельный ген lac-Z, исследователи наблюдали, что сайленсинг происходит в эмбриогенезе (когда впервые цитологически наблюдается гетерохроматин) и эпигенетически наследуется как в соматической, так и в зародышевой линиях; мозаичный фенотип был определен в ходе дифференцировки по мозаичной релаксации сайленсинга у личинок третьего возраста (Lu et al., 1996). Однако не все гены, обнаруживающие мозаицизм, остаются «молчащими» до периода после дифферениировки, и для разных генов баланс факторов, приводящий к решению «включить/ выключить», несомненно различен (дополнительное детальное обсуждение см. Ashburner et al., 2005b).

При наличии мух, имеющих PEV-фенотип, довольно просто провести скрининг на доминантные мутации во втором сайте (индуцированные химическими мутагенами, вызывающими точечные мутации или мелкие инсерции/делеции), которые либо являются супрессорами PEV (обозначаются Supressor of variegation, Su [varj) и приводят к утрате сайленсинга, либо являются энхансерами PEV (обозначаются Enhancer of variegation, E[var]), приводящими к усилению сайленсинга (рис. 5.1). Изолировали и охарактеризовали около 30 модификаторов PEV, но на основе такого скрининга можно предсказать существование значительно большего числа кандидатов на эту роль. Там, где такой ген был клонирован, а его продукт охарактеризован, обычно обнаруживают хромосомный белок или модификатор хромосомного белка (см. ниже). Небольшая выборка этих локусов вызывает как гаплоаномальный, так и триплоаномальный фенотип; т.е. если одна копия гена приводит к супрессии PEV, три его копии приводят к усилению PEV. Идентификация таких локусов привела к предположению, что белковые продукты этих генов играют структурную роль в гетерохроматине и что распространение гетерохроматиновой упаковки может управляться дозой этих белков в стохастическом режиме (рис. 5.2) (Locke et al., 1988). Однако «распространение» является не простым линейным континуумом, а сложным процессом, который, вероятнее всего, зависит от организации ДНК в том районе, который сайленсирован (см. ниже).

Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромосом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохроматиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно подвергнуть генноинженным манипуляциям Р-элемент — ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природных линиях Drosophila. Природный P-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательностиикодируетвсеголишьодинфермент— P-специфическую ДНК-транспозазу Репортерные конструкты, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследователя, можно вставить в геном Drosophila в присутствии активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишенных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина Когда P-элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1 % выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях P-элемент перескочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому (Wallrath and Elgin, 1995). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследованиями.

Рис. 5.2. Зависимые от дозы эффекты некоторых модификаторов PEV

^{Полагают, что модификаторы PEV, обнаруживающие зависимый от дозы эффект, являются структурными белками гетерохроматина. В то время как в присутствии двух копий гена-модификатора дикого типа наблюдается мозаичный фенотип (обнаруживаемый здесь репортерным геном white; средняя хромосома, средний глаз мухи), присутствие трех копий гена-модификатора дикого типа обычно обусловливает более экстенсивное формирование гетерохроматина, что приводит к усилению сайленсинга репортерного гена (нижняя хромосома, нижний глаз мухи). Наоборот, присутствие только одной копии гена-модификатора дикого типа обычно приводит к пониженному формированию гетерохроматина и к повышенной экспрессии репортерного гена (верхняя хромосома, верхний глаз мухи)}

Использование таких P-элементов позволило сравнить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщеплению нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза 1), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зондов, таких как метилтрансфераза dam. Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3а) в эухроматине и в перицентромерном гетерохроматине с использованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения нуклеосом в гетерохроматине (рис. 5.36, в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase, четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкерном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5’-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5’-гиперчувствительных (HS) сайтов (Sun et al., 2001). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных генов, включая утрату связывания TFIID и других транскрипционных факторов (Cryderman et al., 1999b).

2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позволил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков

PEV можно модифицировать различными факторами. Температура во время развития и количество гетерохроматина в геноме были первыми факторами, влияющими, как было показано, на степень мозаицизма. Как правило, повышение температуры во время развития (с 25 до 29°С) приводит к супрессии мозаицизма (утрате сайленсинга), тогда как более низкие температуры (например, 18°С) вызывают усиление мозаицизма (увеличение сайленсинга). Другие изменения в условиях культивирования, ускоряющие или замедляющие скорость развития, могут давать похожие эффекты. Сильная супрессия обнаруживается у мух, несущих дополнительную Y-хромосому (самки XXY и самцы XYY), тогда как у самцов без Y-хромосомы (Х0) обнаруживается значительное усиление. В целом дупликация гетерохроматинового материала подавляет, а делециии гетерохроматинового материала усиливают мозаицизм. Эти эффекты могут быть обусловлены титрованием фиксированного количества ключевых белков, необходимых для упаковки гетерохроматина. Первые мутации во втором сайте, супрессирующие или усиливающие PEV, были идентифицированы Шульцем (Schultz, 1950) и Споффордом (Spofford, 1967). В настоящее время приблизительно 150 генов предположительно рассматриваются как модификаторы локусов PEV.