Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

С годами выявилось несколько универсальных принципов, общих для всех эпигенетических явлений, и эти принципы определяют экспериментальные подходы в наших попытках понять детали. Во-первых, различия между двумя фенотипическими состояниями («ВКЛЮЧЕНО» и «ВЫКЛЮЧЕНО») всегда коррелируют с соответствующим различием структуры в ключевой регуляторной точке — форма транслируется в функцию. Отсюда, основная задача заключается в идентификации этих двух различных структур, компонентов, из которых эти структуры состоят, и композиционных различий между ними Во-вторых, эти различающиеся структуры должны обладать способностью поддерживать и воспроизводить себя в окружении конкурирующих факторов и сил энтропии. Таким образом, каждая структура нуждается в самоусилении, или в контурах положительной обратной связи, обеспечивающих ее поддержание и воспроизведение на протяжении многих клеточных делений; в некоторых случаях, таких как инактивация Х-хромосомы, это время оказывается сравнимым со временем жизни

На 69-м симпозиуме продолжалось уточнение многих механистических принципов, установленных на предыдущих симпозиумах, но были и новые разработки. Чтобы поместить эти новые разработки в наш контекст, важно отметить, что важное влияние на эпигенетику оказали еще два открытия. Одним было открытие РНК-интерференции и родственных, базирующихся на РНК, механизмах регуляции. Другим было открытие механизмов, лежащих в основе гипотезы прионов. За последнее десятилетие обе эти области быстро развивались, и некоторые из этих исследований внесли вклад в наши знания об эпигенетике, базирующейся на хроматине, тогда как другие наметили новые перспективы в проблеме наследственной передачи фенотипов.

Многие достижения, представленные на этом симпозиуме, детально описываются в разных главах этой книги, поэтому я воздержусь здесь от обсуждения этих тем Однако я затрону несколько успешных и перспективных исследований, которые привлекли мое воображение и которые не освещаются на этих страницах В конце я попытаюсь сформулировать наиболее важные концепции, вынесенные мною из этого симпозиума.

3.1. Гипотеза гистонового кода

В ходе рассмотрения модификаций гистонов и их потенциального информационного содержания состоялось много дискуссий относительно «гипотезы гистонового кода» (Jenuwein and Allis 2001). Большинство этих споров, в которых я принимал участие или о которых мне рассказывали, были неформальными и довольно оживленными. Сторонники «кода» приводили такие примеры, как триметилирование гистона H3 по К9 и его повышенное сродство к классу НР1 белков гетерохроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Их противники приводили биохимические и генетические данные о том, что на связывание с ДНК или на фенотип существенно влияет суммарный заряд на аминотерминальном «хвосте» гистона Н4, независимо от того, где этот заряд расположен (Megee et al., 1995; Zheng and Hayes, 2003)

Грюнштейн (Grunstein) представил данные, включавшие анализ модификаций (ацетилирования) гистонов и связанных с хроматином белков во всем геноме S. cerevisiae с использованием специфических антител и метода ChlP-Chip (Millar et al., 2004). Он сделал акцент на ассоциированном с ацетилированием H4K16 эпигенетическом переключении к связыванию или несвязыванию определенных белков хроматина, поддерживая таким образом гипотезу гистонового кода. Некоторые из его данных, хотя они и не обсуждались, по-видимому, свидетельствуют в пользу сообщений других исследователей о том, что для большой части генома нет корреляции между специфичесикми модификациями гистонов и экспрессией генов (т. е. все активные гены имеют одинаковые метки, и эти метки отсутствуют на неактивных генах) (Schubert et al., 2004; Dion et al., 2005). Учитывая всю совокупность этих результатов, я подозреваю, что в качестве механизмов регулирования структуры хроматина и экспрессии генов обычно используются и специфические модификации, и влияние общего заряда

3.2. Динамический «молчащий» хроматин

Я должен признаться, что, основываясь на статических изображениях гетерохроматина и на рефрактерной природе «молчащего» хроматина, я был убежден, что, однажды установившись, гетерохроматиновое состояние остается прочным, как гранит. Только когда наступает время репликации ДНК, эта непробиваемая структура становится релаксированной. Думая таким образом, я неразумно игнорировал принципы равновесной динамики, с которыми познакомился в курсе химии. Однако к этим урокам заставили возвратиться исследования «молчащего» хроматина и гетерохроматина, где было показано, что белки сайленсинга у дрожжей (Sir3) и белки гетерохроматина в клетках млекопитающих (НР1) находятся в состоянии динамического равновесия — эти белки быстро обмениваются между гетерохроматином и растворимым компартментом — даже когда хроматин находится в своем наиболее непроницаемом состоянии (Cheng and Gartenberg, 2000; Cheutin et al., 2003). Осознание динамических качеств хроматина вынудило меня иначе взглянуть на то, каким образом поддерживается и воспроизводится его эпигенетическое состояние. Этот взгляд предполагает, что в некоторых системах эпигенетическое состояние может быть ревертировано в любое время, а не только в ходе репликации ДНК. Отсюда мы можем заключить, что для «молчащего» хроматина механизмы усиления и воспроизведения должны функционировать постоянно.

Широко распространено мнение, что метилирование гистонов является модификацией, накладывающей на хроматин «перманентную» метку (обзор см. Kubicek and Jenuwein, 2004). В противоположность всем другим модификациям гистонов (например, фосфорилированию, ацетилированию, убиквитинированию) нет известных ферментов, которые могли бы обратимо удалять метальную группу с аминогруппы лизина или аргинина. Более того, считается, что удаление метальной группы простым гидролизом в физиологических условиях невыгодно и, таким образом, вряд ли происходит спонтанно.

Несколько сообщений слегка поколебали систему верований тех, кто думал, что метки метилирования являются перманентными. Во-первых, было показано, что ядерная пептидиларгининдеиминаза (PAD4) может удалять монометилирование с остатков аргинина (R) гистона H3 (Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Хотя результатом этого процесса удаления метального компонента является конвертация остатка аргинина в цитруллин, и, следовательно, это не является истинной реверсией данной модификации, он, тем не менее, представляет собой механизм элиминации перманентной метильной метки.

Робин Олшайр (Robin Allshire) привел провоцирующий генетический аргумент, согласно которому ген tis2 из S. pombe ревертирует диметилирование по К9 в гистоне H3 (R. Allshire, личное сообoщение). Возможно, он был на верном пути, поскольку через несколько месяцев после симпозиума было показано, что неродственный фермент LSD1 из млекопитающих специфически деметилирует ди- и монометилы на гистоне H3 по K4 (Shi et al., 2004), ревертируя «активную» метку хроматина. Весьма интересно, что LSD1 не работает на триметилированном H3K4 — таким образом, метилирование может быть ревертировано в ходе процесса маркировки, но реверсия невозможна, коль скоро метка полностью созрела.

Однако Стив Хеникоф (Steve Henikoff) описал способ, которым могла бы элиминироваться перманентная триметиллизиновая метка Он показал, что вариантный гистон H3.3 может замещать канонический гистон H3 независимым от репликации и сопряженным с транскрипцией образом (Henikoff et al., 2004). По существу гистон, содержащий метильные метки для сайленсинга, мог бы быть удален и заменен гистоном, более подходящим для транскрипции. Когда был изолирован суммарный хроматин, оказалось, что гистон H3.3 имел на себе намного больше меток метилирования хроматина (например, K79me), чем канонический гистон H3.

При рассмотрении всех этих результатов создается впечатление, что может и не быть простой молекулярной модификации гистонов, которая служит как метка памяти для воспроизведения состояния «молчащего» хроматина в холе клеточного деления. Скорее, должен иметь место тонкий набор взаимодействий, увеличивающих вероятность того, что «молчащее» состояние будет поддерживаться, хотя и не гарантирующих это.

3.3. Ядерная организация

Корреляции между ядерной локализацией и экспрессией генов были установлены уже много лет назад (Mirkovitch et al., 1987). На основе этих наблюдений начало формироваться мнение, что в клетке имеются специальные компартменты, которыми ограничены экспрессия генов или сайленсинг. Приводили доводы в пользу того, что такая организация необходима для поддержания сложности генома и его регуляции в работоспособном состоянии. Эта идея была поддержана исследованиями на S. cerevisiae, где теломеры преимущественно локализовались на периферии ядра, как и ключевые компоненты комплекса сайленсинга, такие как Sir4 (Palladino et al., 1993). Результатом мутаций, высвобождающих теломеры или Sir4 с ядерной периферии, является утрата теломерного сайленсинга (Laroche et al., 1998; Andrulis et al., 2002). Более того, искусственная привязка частично сайленсированного гена к этой периферии делала его полностью сайленсированным (Andrulis et al.. 1998).

В очень информативном эксперименте Гассер показал, что если теломеры и сайленсирующий комплекс высвобождаются с периферии и могут свободно перемещаться по всему ядру, легко устанавливается теломерный сайленсинг (Gasser et al., 2004). Таким образом, по-видимому, нет особой нужды локализовать локусы в компартменте. Это в большей мере согласуется с данными о том, что быстрое перемещение белков хроматина на хромосомы и с хромосом может, кроме того, опосредовать такую эффективную регуляцию, как сайленсинг. Возможно, чтобы поддерживать высокие локальные концентрации связанных с этим факторов в специальных (стрессовых?) условиях, какая-то локализация и необходима. Или же это может быть комбинацией доменов, собранных вместе в ходе эволюции, которая давно работает без всякой конечной цели.

3.4. Прионы

Викнер дал обзор прионов и критерии для их определения, и из его описания становится ясным, что они (прионы) — это часть эпигенетического ландшафта (Wickner et al., 2004a,b). В простейшем молекулярном смысле прионы — это белки, которые могут вызывать наследуемые фенотипические изменения, действуя на родственный этим белкам генный продукт и изменяя его. Никаких изменений нуклеотидной последовательности ДНК не происходит; скорее, прион, в общем случае, навязывает своему субстрату некое структурное изменение. Прионы, относящиеся к лучше всего изученному и понятому классу, заставляют растворимые формы белка преобразовываться в амилоидные волокна. Во многих случаях эта амилоидная форма снижает или вовсе устраняет нормальную активность данного белка, вызывая таким образом изменение в фенотипе. Викнер определил еще один класс прионов, которые не формируют амилоидных нитей. Это ферменты, для активации которых требуется своя же ферментативная активность. Если клетка обладает лишь неактивными формами этого энзима, тогда необходим внешний источник активного энзима, чтобы положить начало тому, что затем станет самовоспроизводящимся признаком, пока по крайней мере одна активная молекула передается каждой клетке. Он привел два примера и выразил уверенность в том, что этот класс белков составит новую группу эпигенетических механизмов для исследования.

Ши представил предварительные данные о том, прионная модель может объяснить научение и память у Aplysia (Si et al., 2004). В нейрональных клетках этого моллюска трансляция ряда запасенных и PH К в белки важна для поддержания кратковременной памяти. Он обнаружил, что регулятор белковой трансляции, СРЕВ, может существовать в двух формах и что активированная форма СРЕВ действует доминантно, воспроизводя себя. Проверка этой идеи все еще находится в самом начале, но обещает фантастические новые подходы на тему о том, каким образом мы помним.

3.5 Новое явление

Описание нового и неожиданного феномена всегда поражает наше воображение. Одно сообщение в особенности занимало мои мысли на протяжении нескольких недель после симпозиума Стандартный генетический анализ мутантных аллелей гена HOTHEAD, регулирующего слияние органов у Arabidopsis, показал, что обычные правила менделевской генетики здесь не выполняются (Lolle et al., 2005). Оказалось, что если гетерозиготные (HOTHEAD/hothead) растения самоопыляются и производят гомозиготное растение hothead/hothead, а затем этому гомозиготному растению hothead/hothead дают самоопылиться, потомство от этого гомозиготного родителя ревертирует к генотипу HOTHEAD/hothead с частотой до 15 %. Этот потрясающе высокий уровень реверсии к дикому типу давал, на нуклеотидном уровне, точный дубликат гена дикого типа, наблюдавшегося в предшествующих поколениях. Эта реверсия не ограничивалась локусом HOTHEAD — несколько других локусов обнаруживали сходные частоты реверсии к аллелям дикого типа. Однако для всех этих реверсий требовалось, чтобы родитель был гомозиготным hothead/hothead. Продукт гена HOTHEAD не дает никакого очевидного объяснения, как такое может происходить, но прошедшие обсуждения определенно заставляют предполагать, что некая архивная копия гена дикого типа передавалась в ряду последовательных поколений, возможно через РНК. Хотя можно возразить, что это явление лежит вне сферы «эпигенетики», — поскольку связано с изменениями в нуклеотидной последовательности ДНК, — наследственная передача этой предполагаемой архивной копии не подчиняется нормальным генетическим правилам. Так или иначе, этот феномен чреват огромными последствиями для генетики, особенно в области эволюционного мышления.

4. Заключительные соображения

Итак, что еще нужно сделать, чтобы понять эпигенетические механизмы? По большей части мы все еще собираем (открываем) их отдельные компоненты. Точно так же, как полная последовательность генома чрезвычайно облегчила прогресс в области генетики, так и более ясное понимание эпигенетики придет, вероятно, тогда, когда станут известными все составные части. Успехи, достигнутые за последнее десятилетие, очень вдохновляют.

Признаюсь, я не в состоянии различить, близки ли мы или далеки от точного, в механистическом плане, понимания того, каким образом поддерживаются и воспроизводятся эпигенетические состояния. Первым, возможно, придет понимание феноменов, базирующихся на прионах; те же явления, которые базируются на хроматине, по-видимому, наиболее далеки от этого. Поливалентная природа взаимодействий, которые, по-видимому, необходимы для установления сайленсированного состояния на хромосоме, увеличивает сложность проблемы. Последняя еще более усложняется динамической природой «молчащего» хроматина. Возможность узнать больше о движении компонентов в хроматиновые структуры и из них требует для окончательного понимания применения усовершенствованных или совсем новых методов. Иммунопреципитация хроматина, оказавшаяся важной в установлении того, какие компоненты находятся в составе структуры, временно заслонила от нас динамику.

Я подозреваю, что, учитывая эту сложность, простое измерение констант связывания и равновесия для всех компонентов и попытки получить систему дифференциальных уравнений для имитации эпигенетических переключателей могут оказаться неэффективной тратой ресурсов и не обязательно приведут к лучшему пониманию. Скорее, я предполагаю, что потребуется разработка математического подхода нового типа в комбинации с новыми экспериментальными методами измерения для окончательного понимания эпигенетических событий. В частности может потребоваться разработка систем in vitro, надежно воспроизводящих эпигенетическое переключение между состояниями.

Идея конкуренции между двумя состояниями в большинстве эпигенетических явлений, вероятно, отражает «гонку вооружений», происходящую на многих уровнях клетки, за которой следуют попытки исправить «сопутствующий ущерб». Например, белки сайленсинга возникли, возможно, для зашиты генома от транепозонов Однако, поскольку белки сайленсинга работают через посредство вездесущих нуклеосом, становятся репрессированными некоторые критичные гены. Чтобы преодолеть это, возникли модификации гистонов (например, метилирование H3K4 и H3K79) и замещение вариантными гистонами, чтобы предотвращать связывание белков сайленсинга с критичными генами. В зависимости от последующих событий эти изменения могут быть кооптированы для других процессов — например, может стать полезной репрессия некоторых генов белками сайленсинга («молчащие» локусы типа спаривания). Механизмы сайленсинга могут кооптироваться и для других функций, таких как стимуляция расхождения хромосом. И так далее…

Я жду секвенирования геномов новых организмов, поскольку это может привести нас к пониманию последовательности эволюционных событий, приведших к возникновению эпигенетических процессов, которые мы наблюдаем сегодня. Например, у S. cerevisiae отсутствует аппарат RNAi, но у многих других грибов он есть. Заполняя некоторые филогенетические пробелы между видами, мы можем выяснить, какие события привели к тому, что S. cerevisiae больше не «нуждаются» в этой системе.

Изучение эпигенетики, возможно, более, чем какая-либо другая область биологических исследований, основывается на стремлении понять неожиданные наблюдения, начиная с мозаицизма, обусловленного эффектом положения, до полярной сверхдоминантности в фенотипе callipyge (Georges et al., 2004). Надежда понять что-то необычное служит для нас приманкой, но скоро мы приходим в восторг при виде разумности используемых механизмов. Этим можно объяснить, почему эта область привлекла непропорционально много веселых и светлых умов Я подозреваю, что так и будет продолжаться по мере достижения нами более высокого уровня мастерства и открытия новых и неожиданных эпигенетических явлений.

Благодарности

Я благодарю моих коллег в Университете Чикаго и Раковом исследовательском центре Фреда Хатчинсона, которые сделали мои собственные исследования по эпигенетике столь приятными; я благодарен также Национальным институтам здоровья за финансовую поддержку.