Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2. Жизненный цикл дрожжей

Дрожжи S. cerevisiae размножаются путем митотических делений в гаплоидном или диплоидном состоянии, образуя почку, которая постепенно увеличивается и в какой-то момент отделяется от материнской клетки (рис. 4.2а). Гаплоидные клетки дрожжей могут спариваться друг с другом (коньюгировать), поскольку существуют в виде одного из двух типов спаривания, обозначаемых как а и а, напоминающих два пола у млекопитающих. Клетки каждого типа образуют свой феромон, привлекающий клетки противоположного типа: клетки типа а синтезируют 12-членный пептид, называемый а-фактор, который связывается мембранным рецептором а-фактора на поверхности клеток типа α. И наоборот, клетки типа а синтезируют 13-членный пептид. который связывается рецептором α-фактора на поверхности клеток типа а. Эти взаимодействия приводят к остановке клеток на стадии от средней до поздней G1-фазы клеточного цикла. При этом клетки приобретают грушевидную форму, называемую «шму» (shmoo) по имени персонажа известного мультфильма (рис. 4.2б). Клетки противоположных типов сливаются своими выпячиваниями, образуя диплоидную клетку а/а. В диплоидных клетках способность к спариванию репрессирована: они размножаются вегетативно (т.е. путем митотических делений), как и гаплоидные клетки. С другой стороны, в условиях голодания в них индуцируется мейотическая программа, приводящая к формированию аска (сумки) с четырьмя спорами, по две каждого типа спаривания. При поступлении достаточного количества питательных веществ гаплоидные споры превращаются в клетки, способные к спариванию, т.е. возобновляется нормальный жизненный цикл.

Рис. 4.2. Жизненный цикл почкующихся дрожжей

^{(а) Клетки дрожжей митотически делятся в гаплоидной и диплоидной формах. Голодание индуцирует споруляцию диплоидных клеток, а при сближении гаплоидных клеток противоположных типов происходят спонтанные скрещивания. Это является результатом секреции феромонов, вызывающих в клетке противоположного типа остановку клеточного цикла на стадии G1 и, после достаточно продолжительного действия феромона. — индукцию пути спаривания. Диплоидное состояние репрессирует путь спаривания.}

^{(б) В ответ на действие феромона гаплоидные клетки «выпячиваются» по направлению клеток противоположного типа Получающаяся форма называется «шму» (по имени известного мультипликационного персонажа) Ядерная оболочка видна как флюоресценция зеленого цвета}

Хотя в лабораторных условиях гаплоидные клетки дрожжей обычно маркируются одним из двух типов спаривания, в естественных условиях они переключают свои тип спаривания практически с каждым клеточным циклом (рис. 4.3а). Такое переключение индуцируется эндонуклеазной активностью (НО), осуществляющей сайт-специфический двунитчатый разрыв в области локуса МАТ. Происходящий затем процесс конверсии генов переносит информацию о противоположном типе спаривания из конститутивно «молчащего» донорского локуса НМLa или HMRα, в активный локус МАТ. Такие штаммы называют гомоталлическими (homothallic). Это означает, что вегетативно растущая клетка типа МАТа быстро даст МАТα потомство и наоборот. В условиях лаборатории удобно использовать клетки со стабильным типом спаривания, поэтому лабораторные штаммы конструируют с дефектным геном эндонуклеазы НО, что исключает расщепления локуса МАТ и. соответственно, переключение типов спаривания. В результате образуется гетероталлический штамм. Такие штаммы содержат «молчащие» локусы НМ и активный локус МАТ стабильно а- или α-типа. Два «молчащих» локуса типов спаривания (рис. 4.3б), по одному для каждого «пола», поддерживаются в конститутивно «молчащем» эпигенетическом состоянии и стали классической моделью для изучения гетерохроматина.

3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молчащих» локусах типов спаривания НМ и теломерах

У дрожжей информация, детерминирующая типы спаривания (а или а), находится в трех локусах, НМ La, МАТ, и HMRa, III хромосомы. Локусы HMLα (~11 т.п.н. от левой теломеры) и HMRa (-23 т.п.н. от правой теломеры; рис. 4.36,в) расположены между короткими элементами ДНК, называемыми сайленсерами Е и I. Только когда любая из двух «молчащих» кассет копируется и интегрируется в активный локус МАТ, она приобретает способность транскрибироваться в нормальной клетке. Перенос информации из локуса HMLα в локус МАТ приводит к образованию клетки с типом спаривания α (МАТα), а перенос информации из локуса HMRa в локус МАТ — клетки типа а (МАТа) (рис. 4.36). Это показывает, что гены и промоторы в локусах ЯМ невредимы, но находятся в стабильно репрессированном состоянии до тех пор, пока остаются в этих локусах. Это — существенное для поддержания способности к скрещиванию обстоятельство, поскольку одновременная экспрессия в одной и той же клетке транскриптов обоих типов (а и α) приводит к возникновению не способного к скрещиванию стерильного состояния. Регистрация стерильного фенотипа оказалась весьма полезной для идентификации мутаций, нарушающих сайленсинг локусов НМ. Белки-регуляторы сайленсинга (silent information regulatory proteins — SIRs) SIR1, SIR2, SIR3 и SIR4 были обнаружены именно как необходимые для полной репрессии «молчащих» локусов НМ (см. обзор Rusche et al., 2003). Мутации sir2, sir3, и sir4 приводят к полной утрате сайленсинга, в то время как при мутациях sirl лишь часть клеток МАТа утрачивает способность к спариванию из-за нарушения репрессии локуса НМ. Благодаря частичному фенотипу sirl-дефектных клеток удалось показать, что альтернативные состояния (спаривающееся-неспаривающееся) могут наследоваться в последовательных поколениях делящихся генетически идентичных клеток (Pillus and Rine 1989). Это послужило ясной демонстрацией того, что репрессия типов спаривания обладает характерными чертами эпигенетически контролируемого процесса. Кроме того, в других исследованиях было показано, что в образовании структуры гетерохроматина участвуют N-концевые участки молекул гистонов H3 и Н4, белок-активатор репрессора 1 (repressor activator protein 1 - Rap1) и комплекс узнавания ориджинов репликации (origin recognition complex — ORC) (см. обзор Rusche et al., 2003).

Рис. 4.3. Переключение типов спаривания у дрожжей

^{(а) Гомоталлические штаммы дрожжей способны переключать тип спаривания с каждым клеточным циклом. Переключение происходит до репликации ДНК, поэтому и материнская, и дочерняя клетки приобретают новый тип спаривания.}

^{(б) Показано положение «молчащего» и экспрессирующегося локусов типа спаривания на III хромосоме. Активный локус МАТ может переключаться посредством конверсии генов примерно один раз на каждый клеточный цикл, благодаря двунитчатым разрывам ДНК эндонуклеазой НО. Указанные проценты показывают частоту, с которой события конверсии переключают локусы МАТ между противоположными типами. Направленность переключения обеспечивается энхансером рекомбинации (RE) на левом плече III хромосомы.}

^{(в) Репрессия «молчащих» локусов типов спаривания HMR и HML происходит под действием двух сайленсеров, фланкирующих эти гены. Они называются Е (от essential) и I (от important) (Brand et al., 1997) и содержат участки связывания белков Rap1 (R), Abf1 (А) и ORC (О). Комбинируя такие сайты связывания в разных комбинациях, можно создавать искусственные сайленсеры, хотя их эффективность ниже, чем у природных. НМLα и HMRa расположены на расстоянии 12 и 23 т.п.н. от теломеры III хромосомы, соответственно. Домены теломерного гетерохроматина III хромосомы репрессируются независимо от локусов НМ процессом, инициируемым множественными сайтами связывания Rap1 (R)}

Гетерохроматин присутствует также непосредственно по соседству с повторами теломерной ДНК дрожжей (C1-3A/TG1-3). Как упоминалось выше, при интеграции репортерных генов, таких как Ura3 или Ade2, рядом с теломерными повторами происходит их репрессия по мозаичному и эпигенетическому типу (Gottschling et al. 1990) Этот эффект (ТРЕ), как и сайленсинг локусов НМ, зависит от Rap1, Sir2, Sir3, Sir4 и N-концевых участков молекул гистонов (Kayne et al., 1988; Aparicio et al., 1991). Генетические исследования свидетельствуют о том, что, за исключением Sir1, близкие механизмы обеспечивают сайленсинг в области локусов НМ и в примыкающих к теломерам участках. Более того, учитывая способность репортерных генов в субтеломерных участках достаточно часто переключаться между «молчащим» и экспрессирующимся состояниями, данный тип репрессии, по-видимому, весьма близок явлению мозаичности, обусловленной эффектом положения (PEV) у дрозофилы.

У дрожжей четыре белка Sir, осуществляющих репрессию, не имеют существенной взаимной гомологии. Белки Sir1, Sir3 и Sir4 консервативны только у самих S. cerevisiae и близких им видах почкующихся дрожжей. Sir2, напротив, является родоначальником большого семейства НАД-зависимых деацетилаз гистонов, консервативного от бактерий до человека (рис. 4.4). Роль 8п2-подобных деацетилаз гистонов в репрессии транскрипции обнаружена даже у организмов, не имеющих других Sir белков, таких как делящиеся дрожжи и двукрылые. У дрожжей Schizosaccharomyces pombe активность Sir2 необходима для сайленсинга транскрипции вблизи теломер, а у дрозофилы она влияет на стабильность эффекта PEV (см. обзор Chopra and Mishra, 2005). Сопряженный с деацегилированием гидролиз НАД белком Sir2 приводит к образованию О-ацетил-АДФ-рибозы, интермедиата, возможно имеющего свою собственную функцию (Tanner et al. 2000; также см. раздел 13). Важно отметить, что помимо гистонов ферменты семейства Sir2 модифицируют множество других субстратов, причем имеется обширная ветвь этого семейства, состоящая из цитоплазматических ферментов (рис. 4.4). Разнообразие функций Sir2 можно проиллюстрировать тем, что у млекопитающих ферменты этого семейства деацетилируют факторы транскрипции FOXO и р53 в ответ на стресс и повреждение ДНК, изменяя тем самым их взаимодействие. У почкующихся дрожжей Sir2 имеет важную роль помимо участия в сайленсинге, а именно подавляет нереципрокную рекомбинацию высокоповторяющихся генов рДНК локуса в области ядрышка (Gottlieb and Esposito 1989).

4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь «молчащий» домен

Репрессия активности генов в эухроматине может происходить вследствие связывания репрессорного белка или комплекса, узнающего определенную последовательность в промоторе гена и препятствующего движению или посадке аппарата транскрипции. Репрессия в области гетерохроматина достигается другим способом, который не является промотор-специфичным. Она начинается с определенных участков, от которых распространяется непрерывно по всему домену, репрессируя все промоторы, находящиеся в соответствующей области (рис. 4.5) (Renauld et al., 1993). Наиболее четко это было показано с помощью метода иммуно-преципитации хроматина: оказалось, что белки Sir2, Sir3 и Sir4 физически связаны с хроматином по всему «молчащему» субтеломерному домену (Hecht et al., 1996; Strahl-Bolsinger et al., 1997). Доказательства, что такая связь приводит к формированию менее доступной репрессивной структуры были получены в других экспериментах. Например, ДНК «молчащих» доменов хроматина плохо метилировалась экспрессируемой в дрожжевых клетках бактериальной метилазой dam, тогда как последовательности ДНК вне этих доменов метилировались вполне эффективно. По-видимому, гетерохроматин затрудняет доступ к ДНК таким молекулам как dfom-метилтрансфераза (Gottschling. 1992). Аналогично, 3-т.п.н. локус HMR избирательно устойчив к действию определенных рестрикционных эндонуклеаз в изолированных ядрах (Loo and Rine, 1994), а нуклеосомы между двух сайленсер-элементов в «молчащих» локусах НМ расположены близко друг к другу, образуя нуклеазо-резистентный домен, отсутствующий в активных локусах (Weiss and Simpson, 1998). Итак, гетерохроматин у дрожжей имеет особую структурную организацию.

Рис. 4.4. Семейство деацетилаз Sir2

^{Sir2 является прототипом большого семейства НАД-зависимых деацетилаз. Семейство белков Sir2 необычно консервативно и найдено у организмов от бактерий до человека. Его эволюционное древо содержит как ядерные, так и цитоплазматические ветви. Это филогенетическое древо без корня было построено с помощью программ CLUSTAL W® и TREEVIEW® для сравнения последовательности коровых доменов гомологов, идентифицированных в библиотеках кДНК и уникальных генов. Шесть подклассов и несвязанная группа описаны в работе Фрая (Frye 2000). Гомологи млекопитающих обозначены как SirT1-7 жирным шрифтом, а белки почкующихся дрожжей подчеркнуты Остальные обозначены названием вида (модифицировано с разрешения из Frye 2000 [©Elsevier])}

Рис. 4.5. Модель гетерохроматина дрожжей в теломерах и локусах НМ

^{Для распространения SIR-комплексов механизмы сайленсинга и теломер, и НМ-локусов используют Rap1, Sir2, Sir3 и Sir4, но они различаются тем, что теломерный зависит также от yKu, в то время как НМ-сайленсеры используют факторы ORC, Abf1 и Sir1. Предполагается, что теломерный гетерохроматин образует обратную петлю сам на себя. В результате получается структура, защищающая теломеру от деградации. Ее конденсация и сворачивание приводят к сайленсингу генов. В случае HM-гетерохроматина репрессированный домен между сайленсерными элементами состоит из тесно расположенных нуклеосом, образующих конденсированную структуру И теломерные, и НМ «молчащие» области недоступны аппарату транскрипции и деградирующим ферментам}

Не столь ясен вопрос о степени гиперконденсации гетерохроматина у дрожжей и многоклеточных организмов, и обусловленного ею затруднения доступа факторов транскрипции к ДНК. Репрессивный комплекс, образующийся при взаимодействии белков Sir с гистонами, оказался неожиданно динамичным: эти белки могут включаться в хроматин «молчащего» локуса НМ даже при остановке клеток в фазе клеточного цикла, в которой образования гетерохроматина обычно не происходит (Cheng and Gartenberg, 2000). Возможно, именно этим обстоятельством объясняется способность Sir-содержащего хроматина связываться с определенными факторами транскрипции даже в репрессированном состоянии (Sekinger and Gross, 1999). Тем не менее, хотя эти исследования и свидетельствуют о том, что гетерохроматин не является механическим препятствием для связывания с ДНК всех негистоновых белков, в нем не обнаруживается транскрипционной активности и связанных РНК-полимераз. Судя по результатам экспериментов Чена и Видома (Chen and Widom, 2005), специфически подавляемым гетерохроматином процессом является связывание с промотором комплексов РНК-полимеразы II и транскрипционных факторов TFIIB и TFIIE. Итак, хотя «молчащий» хроматин дрожжей является динамичным образованием, допускающим обмен белков SIR и, возможно, некоторых факторов транскрипции, он избирательно препятствует связыванию основного аппарата транскрипции и тем самым блокирует синтез мРНК (более детально см. главу 10).

5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина

Формирование гетерохроматина у всех видов включает несколько молекулярных этапов, некоторые из которых были найдены и у почкующихся дрожжей. Один из наиболее изученных из них — сайт-специфическая нуклеация гетерохроматина, требующая участия сайт-специфических ДНК-связывающих факторов. Затем гетерохроматин распространяется из сайтов инициации. Распространение ограничивается специальными пограничными механизмами, которые у дрожжей хорошо изучены. Наконец, дрожжи успешно использовали для демонстрации роли субъядерных компартментов в опосредованной гетерохроматином репрессии. Формирование гетерохроматина в области теломер несколько отличается от его формирования в локусах НМ, но в обоих случаях действует общий принцип, что специфические ДНК-связывающие факторы инициируют распространение репрессоров общего назначения. В деталях эти механизмы описаны ниже (рис. 4.6).

Рис. 4.6. Этапы сборки теломерного гетерохроматина

^{ЭТАП 1. Рекрутирование Sir4, затем Sir2 и Sir3 связанным с теломерами Rap1. Нателомерах Rap1 и yKuрекрутируют Sir4даже в отсутствии Sir2 и Sir3. Только Sir4 может быть рекрутирован в отсутствии остальных Sir-белков, причем его связыванию препятствуют Rifl и Rif2 (Mishra and Shore 1999).}