Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Watanabe Y., Yokobayashi S., Yamamoto M., and Nurse P. 2001. Premeiotic S phase is linked to reductional chromosome segregation and recombination. Nature 409: 359-363.

Watson J.D. 2003. Celebrating the genetic jubilee: A conversation with James D. Watson. Interviewed by John Rennie. Sci. Am. 288: 66-69.

Wei Y., Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Phos­phorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109.

Whetstine J.R., Nottke A., Lan R., Huarte M., Smolikov S., Chen Z., Spooner E., Li E., Zhang G., Colaiacovo M., and Shi Y. 2006. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases. Cell 125: 467-481.

Wolffe A.P. and Matzke M.A. 1999. Epigenetics: Regulation through repression. Science 286: 481-486.

Wysocka J., Swigut T., Milne T.A., Dou Y., Zhang X., Burlingame A.L., Roeder R.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D. 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872.

Yan Q., Huang J., Fan T., Zhu H., and Muegge K. 2003. Lsh, a modulator of CpG methylation. is crucial for normal histone methylation. EMBO J. 22: 5154-5162.

Yu B., Yang Z., Li J., Minakhina S., Yang M., Padgett R.W., Steward R., and Chen X. 2005. Methylation as a crucial step in plant micro RNA biogenesis. Science 307: 932-935.

Zhang Y. and Reinberg D. 2001. Transcription regulation by histone methylation: Interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360.

Zhang Y., LeRoy G., Seeiig H.R, Lane W.S., and Reinberg D. 1998. The dermatomyositis-specific autoantigen Mi2 is a component of a complex containing histone deacetylase and nucleosome remodeling activities. Cell 95: 279-289.

Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Michael Grunstein¹ и Susan М. Gasser²

1University of California, LosAngeles, California 90095-1570

2Fried rich Miescher Institute for Biomedical Research, 4058 Basel, Switzerland

Общее резюме

В ядре эукариот фракция хроматина, содержащая активные гены, называется эухроматином. Во время митоза она подвергается конденсации, чтобы обеспечить сегрегацию хромосом, а в интерфазе клеточного цикла снова деконденсируется, чтобы сделать возможной транскрипцию. Цитологическими методами было обнаружено, что некоторые хромосомные домены остаются конденсированными и во время интерфазы. Эти конститутивно компактные участки хроматина и были названы гетерохроматином. С развитием новых методов эту часть генома стали определять по молекулярным, а не цитологическим критериям: было показано, что конститутивно компактный хроматин в области центромер и теломер содержит тысячи копий простых повторяющихся последовательностей. Такой гетерохроматин, как правило, реплицируется на поздних этапах S-фазы клеточного цикла и образует скопления по периферии ядра и вблизи ядрышка. Существенной чертой гетерохроматина является способность к стохастичному распространению своей характерной, устойчивой к действию нуклеаз, структуры и связанной с нею репрессии транскрипции на соседние гены. Например, в случае гена white дрозофилы, детерминирующего красный цвет глаз, такая эпигенетическая репрессия проявляется в появлении чередующихся красных и белых участков глаза. Это явление получило название «мозаичность, обусловленная эффектом положения» (position-effect variegation — PEV) В его основе — узнавание метилированной по 9-му остатку лизина формы гистона H3 (H3K9) гетерохроматиновым белком 1 (heterochromatin protein 1 — НР1) и распространение этой метки вдоль хромосомы. У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ходе эволюции возник другой механизм образования гетерохроматина, но приводит он к очень похожему результату.

S. cerevisiae — микроорганизм, широко используемый при производстве пива и в хлебопечении. Однако, в отличие от бактерий, это — эукариот. Хромосомы у пекарских дрожжей, как и у более сложно организованных эукариот, связаны с гистонами, заключены в ядро и реплицируются в ходе S-фазы клеточного цикла с использованием множественных точек начала репликации (ориджинов).

Тем не менее, геном у дрожжей очень маленький: всего 14 миллионов пар оснований ДНК на 16 хромосом. Это ненамного больше, чем геномы некоторых бактериофагов. Всего в геноме дрожжей около 6000 довольно тесно расположенных генов: промежутки между ними обычно составляют не более 2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Подавляющее большинство генов у дрожжей находится в хроматине открытой конфигурации, обеспечивающей их активную транскрипцию или возможность ее быстрой индукции. Это обстоятельство и очень небольшое количество простых повторяющихся последовательностей ДНК делает практически невозможной детекцию гетерохроматина у дрожжей цитологическими методами.

Тем не менее, с помощью молекулярных методов было показано, что у дрожжей имеются четко выделяющиеся гетерохроматиновые участки по соседству с теломерами всех 16-ти хромосом, а также в двух «молчащих» локусах типов спаривания III хромосомы. Репрессия транскрипции этих двух локусов существенна для поддержания компетентного к спариванию гаплоидного состояния. И субтеломерные области, и «молчащие» локусы типов спаривания репрессируют интегрированные репортерные гены позиционно-зависимым эпигенетическим механизмом, реплицируются во время поздней S-фазы и расположены по периферии ядра. Таким образом, эти локусы имеют все характерные для гетерохроматина черты, за исключением цитологически наблюдаемой конденсации в интерфазе. Для ученого, изучающего гетерохроматин, дрожжи сочетают преимущества малого генома, возможности использования генетических и биохимических методов исследования микроорганизмов и важные аспекты организации хромосом высших эукариот.

1. Генетические и молекулярные методы исследования дрожжей

Дрожжи представляют собой гибкую и быструю генетическую систему для изучения клеточных процессов.

При времени клеточной генерации около 90 мин. всего за два дня можно вырастить колонии, содержащие миллионы клеток. К тому же дрожжи можно поддерживать в гаплоидной и диплоидной формах, что резко упрощает их генетический анализ. Как и бактерий, гаплоидные клетки дрожжей можно использовать для получения ауксотрофных мутантов со специфическими требованиями к составу питательной среды. Рецессивные летальные мутации можно поддерживать в культуре гаплоидных клеток в виде условных летальных аллелей (например, температуро-чувствительных мутантов) или в культуре гетерозиготных диплоидных клеток (содержащих и аллель дикого типа и мутацию). Наличие высокоэффективной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей позволяет произвольно изменять любую выбранную хромосомную последовательность ДНК. К тому же, можно осуществлять манипуляции с участками хромосом в составе рекомбинантных плазмид, которые стабильно поддерживаются в делящихся клетках дрожжей, благодаря включению в них коротких последовательностей центромеры и ориджина репликации ДНК. В дрожжах стабильно поддерживаются даже линейные плазмиды (минихромосомы), содержащие теломерные повторы по концам.

Явление мозаичности, обусловленной эффектом положения, на модели репортерного гена white дрозофилы сыграло важную роль в изучении эпигенетической регуляции генов, а также генов, влияющих на эту уникальную форму репрессии (см. более детально в главе 5). Открытию и изучению аналогичного явления в области теломер у дрожжей, теломерного эффекта положения (telomere position effect — ТРЕ) помогло использование в качестве репортерных генов Ura3 и Ade2 (рис. 4.1). В присутствии 5-фтороротовой кислоты (5-fluoroorotic acid-5-FOA) продукт гена Ura3 превращает ее в 5-фторурацил (5-fluorouracil-5-FU) — ингибитор синтеза ДНК, вызывающий гибель клеток Однако, при интеграции в область гетерохроматина ген Ura3 оказывается репрессированным в части клеток, и именно эти клетки оказываются способными расти на среде с 5-FOA. Таким образом, определяя эффективность роста на среде с 5-FOA с помощью серийных разведений культуры клеток дрожжей (рис. 4.1а), можно количественно измерять степень репрессии репортерного гена в очень широких пределах (например, в 10— 106-кратных). Более того, мутации, нарушающие ТРЕ, могут быть легко идентифицированы по повышению чувствительности к 5-FOA.

Аналогично, при интеграции гена Ade2 в область гетерохроматина происходит его репрессия, и в клетке накопливается предшественник биосинтеза аденина, окрашивая ее в красный цвет Существенно, что эпигенетическая природа репрессии Ade2 видна в пределах одиночной колонии генетически идентичных клеток. Ген может быть «включен» в некоторых клетках и «выключен» в остальных. Внешне это проявляется как наличие красных участков на фоне белой колонии или наоборот (рис. 4.16). В отличие от теста с использованием Ura3, селекции против клеток, в которых остался не репрессированным ген Ade2, не происходит, поэтому фенотип клеток с интегрированным в субтеломерный гетерохроматин геном-репортером можно использовать как показатель скорости переключения и наследования эпигенетического состояния. Цветной тест с использованием Ade2 представляет собой удивительную иллюстрацию полустабильной природы репрессированного и дерепрессированного состояний.

Рис. 4.1. Сайленсинги ТРЕ у дрожжей

^{(а) Ген Ura3, встроенный рядом с простыми TG-богатыми теломерными повторами в левом плече VII хромосомы, подвергается сайленсингу теломерным гетерохроматином в данном штамме дрожжей. При выращивании на обычной богатой среде (YPD) не наблюдается различий между клетками дикого типа (wt), клетками с репрессированным субтеломерным геном Ura3 и мутантами по сайленсингу, у которых теломерный гетерохроматин утрачен, а ген Ura3 экспрессируется. На среде, содержащей 5-FOA (нижняя панель), с другой стороны, клетки с репрессированным геном Ura3 (например, клетки дикого типа) могут расти, а клетки, экспрессирующие его (sir2nyku70 мутанты), не могут. Это объясняется тем, что продукт гена Ura3 превращает 5-FOA в токсичный интермедиат 5-фторурацил. Тест с серийными разведениями позволяет детектировать события сайленсинга даже при частоте 1 на 106 клеток.}

^{(б) Клетки, содержащие ген Ade2 дикого типа, дают «белую» колонию, а клетки с мутантным ade2 — красную, что связано с накоплением красного интермедиата биосинтеза аденина. При встраивании гена Ade2 рядом с теломерой в правом плече V хромосомы происходит его эпигенетический сайленсинг. И «молчащее», и активное состояния гена Ade2 наследуются в генетически идентичных клетках, в результате чего образуются колонии с белыми и красными секторами (весьма похоже на картину, наблюдаемую при PEV)}

Вместе с описанными генетическими подходами к протеазо-дефицитным штаммам, растущим в синхронных и асинхронных крупномасштабных культурах, вполне применимы биохимические методы. В последние годы арсенал доступных средств расширился изощренными методами анализа с помощью микрочипов и белковых сетей, легко охватывающих весь небольшой геном дрожжей. Эти методы позволяют осуществлять полногеномный анализ транскрипции, связывания факторов транскрипции, модификации гистонов и белок-белковых взаимодействий. Этот широкий арсенал изощренных методов позволил ученым исследовать механизмы регуляции формирования гетерохроматина и его физиологическую роль в клетках дрожжей. Однако, прежде чем описать эти открытия, необходимо более детально рассмотреть жизненный цикл дрожжей.