Лысенко был прав!: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Не правильно журналисты описывают и приоритеты. Первым ученым, который в 1986 г. опубликовал результаты клонирования млекопитающих, был эмбриолог С. М. Уиллэдсен (236). Он предложил вместо клеток раннего эмбриона, куда раньше пересаживались ядра соматических клеток при создании клонов, использовать яйцеклетку (235).

До клонирования Долли уже предпринимались попытки создать полноценные клоны. Среди них — овцы Мэган (англ. Megan) и Мораг (англ. Morag), созданные той же группой исследователей из эмбриональных клеток (а не клеток взрослых животных). Статья о них была опубликована в журнале Природа (Nature) в 1996 г. (141). Вскоре после Долли из клеток взрослых животных удалось вырастить мышь, козу, свинью, корову, кошку.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, а in vivo — в перевязанном яйцеводе овцы — промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уилэдсен предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы (235). Культивирование соматических клеток в среде с резко пониженным содержанием сыворотки крови оказалось несущественным элементом метода (231).

Далее метод включает следующие этапы (231). 1. Удаление ядра из яйцеклетки с помощью микропипетки. 2. Внедрение в цитоплазму оставшейся яйцеклетки ядра соматической клетки (сейчас принята другая методика, которая оправдала себя в случае с Долли — соматическая клетка с помощью микроманипулятора помещалась под блестящую оболочку и затем под воздействием электрического импульса обеспечивалось ее слияние с яйцеклеткой). 3. Активация полученной зиготы с целью стимулировать ее деление. Для этого на зиготу воздействуют таким образом, чтобы вызвать повышение концентрации ионов кальция в ее цитоплазме. Кроме того с помощью лекарств блокируется синтез белков. 4. Культивирование в пробирке начавшего делиться эмбриона. 5. Подсадка эмбриона суррогатной матери.

Если при манипуляциях с яйцеклеткой сохраняется ее блестящая оболочка, состоящая из внеклеточного вещества, то соматическая клетка просто внедряется в пространство между плазматической мембраной безъядерной яйцеклетки и блестящей оболочки и затем вызывается с помощью определенного электрического импульса слияния яйцеклетки и соматической клетки. Затем повышают содержание ионов кальция в цитоплазме зиготы и добавляют блокаторы синтеза белка. Эти два стимула достаточные для того, чтобы заставить зиготу делиться (дробиться).

Проверка способности ядер разных соматических клеток (взятых от разных тканей, а их около 200 у человека) обеспечивать создавать после пересадки в лишенную ядра яйцеклетку создание целого организма обнаружила, что только около 12 тканей из 200 обладают этими свойствами, то есть их ДНК дифференцирована (изменена в процессе созревания) обратимо (231).

Пока выход положительных результатов очень невелик. Поскольку в серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, то это говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36 %). Что касается этической стороны дела, клонирование человека вызывает еще больше возражений. Во-первых, становление человека как личности, базируется не только на биологической наследственности, оно определяется также семейной, социальной и культурной средой. При клонировании индивида невозможно воссоздать все те условия воспитания и обучения, которые сформировали личность его прототипа (донора ядра).

С момента рождения Долли биологи создали массу самых разнообразных зверей. В 2009 году на свет появились "копии" буйвола, козы и верблюда. В Америке клонирование собак вообще поставили на поток. Но, по сути, Долли не является клоном. Клоном является группа организмов, имеющих идентичный геном, после бесполого размножения от одного предшественника. Долли имеет другие генетические факторы цитоплазмы, не такие как ее генетическая мама, от которой взято соматическое ядро. Долли — это генетическая копия.

IV.1. ДОЛЛИЕВЫ ПРОБЛЕМЫ

Опыты на Долли показали, что геном млекопитающих не подвергается необратимым изменениям во время клеточной и тканевой дифференцировки и эмбрионального развития.

Цитоплазма обычной клетки не может обеспечить развития целого организма (231, 238), а у растений может, но нужны направители и индукторы в виде гормонов или других клеток. Но главным лимитирующим фактором является видовая специфичность. С яйцеклетками, взятыми от другого вида животных клонирование не получается. Другой вид, даже с тем же числом хромосом, видимо, не работает, так как там цитоплазматические факторы не прошли тест на "негибридизационность", как это делается во время видообразования. Кроме того однотипные гены у другого вида могут располагаться в разных хромосомах.

Однако сам по себе метод вызывает множество вопросов. Конечно, при этих очень грубых манипуляциях с яйцеклеткой теряется часть цитоплазмы яйцеклетки, при удалении ядра яйцеклетки остается часть ее ДНК или наоборот засасывается в микропипетку и удаляется избыточная часть цитоплазмы яйцеклетки. Куски оставшейся ДНК могут захватываться в новые ядра, которые формируются во время деления, а точнее дробления, оплодотворенной яйцеклетки, которая после оплодотворения носит название зиготы. Это потом ведет к нарушениям в реализации программы развития. В яйцеклетке остается масса мРНК от прошлого хозяина. Здесь возможна молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. В яйцеклетке остается белковая наследственность от предыдущего животного. Именно этим, по-видимому, объясняется очень малая воспроизводимость получения гибридов млекопитающих из соматических клеток.

По сути, долгое время (277 опытов) авторы искали соматическую клетку, которая пройдет фильтр эмбриогенеза. Все остальные не прошли, комбинация генов оказалась нежизнеспособной из-за накопления невидимых или видимых, то есть затрагивающих жизненные функции белков мутаций. Исследователи брали ядро из соматической клетки после ее долгого голодания (старвации), когда из-за отсутствия питательных веществ (неблагоприятных факторов), видимо, вся ДНК оказывалась спирализированной, как в ядре сперматозоида. Только тогда система реагировала на условия яйцеклетки, где после внедрения ядра со спирализованной ДНК, вся ДНК "расспирализировалась" и гены проверялись на соответствие друг другу. Если хотя бы одна часть из-за метилирования ДНК не спирализировалась, то этот участок избегал контроля и мешал развитию, или же вообще исключался и клетке не хватало части генов, который был заключен в данном участке.

Долли быстрее состарилась и объяснения этому феномену у генетиков нет. Одной из возможных причин могут быть гибридизационные осложнения, связанные с комплементарным склеиванием мРНК. Гибридизационный механизм легко объясняет преждевременное старение Долли. Старение овечки Долли могло быть вызвано мутациями, которые не нарушали состав белковых молекул, но нарушали функцию мРНК. Тот факт, что овечка Долли быстро состарилась, как раз и говорит о том, что соматические клетки накопили массу мутаций, которые не изменили ни одного признака, но ускорили старение. То есть овечка Долли ещё раз показала огромную роль эпигенетических факторов в наследовании.

Недавно было продемонстрировано (181), что мыши женского пола, появившиеся на свет при помощи комбинации двух материнских генов без отца, живут значительно дольше, чем нормальные мыши с комбинацией материнских и отцовских генов. Мыши, не имевшие отцовских генов были выращены из клеток, геном которых формировался из полностью созревшей яйцеклетки одной мыши и из нерастущей яйцеклетки новорожденной мыши. Мышь, порожденная с помощью оплодотворения мыши модифицированными генами другой женской особи, прожила в среднем на 186 дня дольше, чем мышь, возникшая при помощи нормальной комбинации женских и мужских генов. Средний срок жизни мышей, использовавшихся в исследовании, составляет 600700 дней, то есть, модифицированная мышь прожила практически на треть дольше, чем обычная. Одной из интерпретаций данного эксперимента может быть утверждение, что не мужские гены плохи, а хороши гены, взятые у новорожденной особи.

ПРИЛОЖЕНИЕ V. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ

Транспорт веществ в клетке является центральным процессом, объединяющим многие клеточные события и поэтому я надеюсь, что его описание будет полезно не только для иллюстрации того факта, что связь между геном и признаком опосредована множеством ступеней и белковых систем, но и представит интерес для тех, кто просто интересуется биологией клетки. Тем более, что изложенные в российских учебниках сведения о том, как этот процесс организован в клетке, уже значительно устарели. Большинство сведений, которые были использованы при написании данного раздела, я взял из новейшей книги Миронова и Павелки про пластинчатый аппарат Гольджи и внутриклеточный транспорт (200). Кроме того я пользовался имеющимися русскоязычными работами (8, 76, 104, 105, 1 10).

В клетке существует несколько транспортных путей для активного перемещения клеточных органелл от одного места в клетке к другому. Они основаны на работе микротрубочек и актиновых микронитей, состоящих из белка актина и взаимодействующих с белком миозином. Микротрубочки — это как бы канаты, которые постоянно полимеризуются, а потом снова распадаются на отдельные первичные кирпичики-блоки. В виде канатовидных полимеров они используются в качестве рельс для передвижения по ним специальных моторных белков с прикрепленными к ним органеллами или агрегатами белков.

Микротрубочки и актиновые нити могут служить для перемещения органелл, например, митохондрий, пластид, пигментных гранул и др. в ответ на внешние стимулы. Кроме того они задействованы в перемещении синтезированных или поглощенных извне белков и липидов в те места, где они подвергаются конечной обработке, выполняют свои функции или выделяются в окружающую клетку среду (Я здесь не касаюсь поглощения веществ клеткой путем их диффузии через плазматическую мембрану). Эта часть транспортных путей и называется секреторными транспортным путями.

Липиды, большая часть белков, интегрированных в липидные мембраны, белки, которые клетка выделяет во окружающую среду, а также белки, которые остаются в просвете органелл, синтезируются в эндоплазматической сети. Среди белков, которые могут покинуть пределы эндоплазматической сети, можно выделить так называемые растворимые "просветные" (то есть располагающиеся внутри просвета) белки, мембранные белки, то есть белки, у которых один из участков располагается внутри липидного двойного слоя, а также белки, ассоциированные с мембраной эндоплазматической сети со стороны внутреннего просвета. Кроме того со стороны цитоплазмы к мембранам эндоплазматической сети могут приклеиваться белковые молекулы, которые синтезированы в цитоплазме, на рибосомах, которые не были присоединены к эндоплазматической сети.

При этом часть растворимых и мембранных белков не может покинуть эндоплазматическую сеть. Это либо белки, которые предназначены для обеспечения работы самой эндоплазматической сети, либо белки, не отвечающие критериям качества сборки. У первых из них есть специальные механизмы для того, чтобы задерживаться здесь — они не покидают ее пределы, так как у них есть сигналы, которые либо ведут к возврату молекулы, если она покинула пределы сети, либо к приклеиванию к другим белковым агрегатам или другим нетранспортируемым структурам, включая липидные мембраны. К таким белкам относится, например, белок Сек61 и другие ассоциированные с ним мембранные и растворимые люминальные (находящиеся в просвете и не имеющие связей с мембраной) белки, которые обеспечивают проникновение белков, синтезированных на мембранно-ассоциированных рибосомах, в просвет вакуолей и трубок эндоплазматической сети. Обычно белки, функционирующие на уровне эндоплазматической сети, образуют агрегаты с участием ионов кальция или имеют механизмы, которые обеспечивают возврат белков, если эти белки выходят из эндоплазматической сети.

Некоторые белки удерживаются в эндоплазматической сети и аппарате Гольджи в качестве постоянных компонентов. Белок-рецептор SRP встречается только в мембране эндоплазматической сети, а ферменты, обрабатывающие, олигосахариды, расположены только в мембранах определенных цистерн Гольджи и т. д. Это связано с наличием специальных сигналов сортировки для каждого этапа продвижения продукта через эндоплазматический ретикулум и АГ. Каждый постоянный компонент эндоплазматической сети. АГ, других органелл по ходу секреторного и эндоцитозного пути должен иметь специальный сигнал, отвечающий за его сохранение в этом компоненте мембраны эндоплазматической сети и каждого типа цистерн АГ должны иметь специальные механизмы для сохранения своей уникальности. Сигналы могут быть двух типов, удерживающие и возвращающие. В первом случае белок прикрепляется к какой-нибудь структуре, или использует какое-нибудь свойство данного участка органеллы для того, чтобы из него никуда не двигаться. Во втором случае, белок использует механизмы, обеспечивающие его возврат назад — рециклирование.

Наконец, молекула белка может покинуть пределы эндоплазматической сети только после того, как она прошла контроль правильности своей трехмерной упаковки (что часто включает такие начальные этапы как Н-гликозилирование с образованием цепочки моносахаров и ее последующим частичным обрезанием). Если молекула не отвечает критериям качества, то она задерживается в сети.

V.1. ТРАНСПОРТ МЕЖДУ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕТЬЮ И АППАРАТОМ ГОЛЬДЖИ

На участке транспорта от эндоплазматической сети к аппарату Гольджи можно выделить три этапа: 1) собственно выход из эндоплазматической сети, 2) централизация и доставка к аппарату Гольджи и 3) вход в него.

Для того чтобы выйти из эндоплазматической сети, белки и липиды используют так называемые места выхода из эндоплазматической сети. Эти участки выхода имеют своеобразное строение. В области выходов из эндоплазматической сети имеются так называемые «тубулярно-везикулярные кластеры» (200). Это совокупность трубчатых и везикулярных структур. На цистерне (в наших аналогиях — макаронине) гранулярной (покрытой рибосомами) эндоплазматической сети имеются мембранные почки. Рядом находятся несколько анастомозирующих трубок и пузырьков. Пузырьки довольно редкие. Они имеют диаметр 60–70 нм и, как правило, их мембрана не имеет выраженного белкового покрытия.

Трубки часто содержат локальные сферические расширения. Иногда на цистерне макаронины, то есть эндоплазматической сети, образуется мембранная почка. Эта почка имеет хорошо заметное под электронным микроскопом белковое покрытие. Покрытие формируется коатомером-2, образует сплетение типа такого, что было на советской сетке-авоське, сплетенной из веревок. Только отверстия, образуемые покрытием, шестиугольные и пятиугольные. Если мячик поместить в такую авоську и положить на стол, то он будет похож на подобную мембранную почку, на которой имеются выступающие перемычки, образующие сетчатый рисунок на поверхности мяча. Рисунок веревок состоит из шестиугольников и пятиугольников, что соответствует рисунку футбольной камеры.

V.2. МЕХАНИЗМЫ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ПРИ ВЫХОДЕ ИЗ ЭР

Для увеличения эффективности работы системы перед выходом из эндоплазматической сети мембранные белки подвергаются концентрированию. Все экспортируемые из эндоплазматической сети мембранные белки делятся на такие, которые подвергаются концентрированию на выходе из эндоплазматической сети и те, что концентрированию не подвергаются или этот процесс происходит уже в аппарате Гольджи.

Одним из непременных условия для эффективного концентрирования мембранных белков в эндоплазматической сети является их способность образовывать димеры или тримеры, то есть склеиваться попарно или по трое. Склеивание происходит, как правило, в области того участка белка, который обращен в просвет вакуоли эндоплазматической сети (то есть внутрь нашей макаронины). Та же часть аминокислотной цепи, которая обращена в цитоплазму имеет небольшие участки, которые способны приклеиваться к мелким единицам, образующим коатомер-2.