Лысенко был прав!: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Коатомер-2 составлен из 5 субъединиц, 4 из которых в свою очередь попарно склеены. Сек23 склеен с Сек24. Сек13 склеен с Сек31. В приклеивании экспортируемого белка к коатомеру 2 участвует небольшой белок Сар1 п, который способен гидролизировать (расщепить) ГТФ. Он бывает в двух состояния: 1) когда к нему приклеена ГДФ, 2) когда к нему приклеена ГТФ. В первом случае он не приклеивается к мембране. Во втором его трехмерная структура изменяется и он стремится приклеиться к мембране эндоплазматической сети. После его приклеивания к мембране он также склеивается с парой Сек23-Сек24, а та, в свою очередь, присоединяется к нашему экспортируемому мембранному белку.

Приклеивание экспортируемого мембранного белка к комплексу, состоящему из Сар1п и Сек23/24, ведет к тому, что последняя белковая пара склеивается также с парой Сек13-Сек31. Образуется линейный гетерополимер, состоящий и следующей цепи разнородных мономеров: белок/Сар1 п/Сек23/Сек24/Сек13/Сек31. Сек31 может приклеиваться к другой такой же цепи. В результате образуется полимер, который не только состоит из разных белков, но так же, как нитка при прошивании ткани, ныряет туда и обратно через мембрану: просветная часть нашего белка — трансмембранный участок (проход через мембрану) — участок, смотрящий в цитоплазму — Сар1 п — Сек23 — Сек24 — Сек13- Сек31 — Сек31-Сек13 — Сек24 — Сек23 — Сар 1 п — цитоплазматический участок — трансмембранный участок (обратный проход через мембрану) — просветный участок — (где имеется склеивание двух молекул нашего белка) просветный участок — трансмембранный участок и т. д. В результате экспортируемые мембранные белки оказываются включенными в эти длинные полимеры, которые могут ветвиться. Тем самым мембранные белки подвергаются концентрированию.

Возникающие гетерополимеры и приводят к тому, что экспортируемые мембранные белки концентрируются в месте выхода из эндоплазматической сети. Сходным образом осуществляет концентрирование белков-СНАРЕ. Таким образом, белки СНАРЕ и экспортируемые белки в зонах выхода из эндоплазматической сети имеют более высокую концентрацию, чем в остальных участках эндоплазматической сети.

Когда наш белок сконцентрирован, начинается процесс удаления покрытия. При этом пара: Сек13-Сек31 активирует пару

Сек23-Сек24. Она в свою очередь активирует Сар 1 п, который без этой активации может гидролизировать ГТФ, но делает это очень и очень медленно. В результате Сар1 п отщепляет фосфорный остаток от ГТФ, лишается способности заякориваться в мембране и все покрытие распадается и отщепляется от мембраны. Но наш белок уже сконцентрирован в сравнительно изолированной мембранной структуре, что мешает его обратной диффузии в цистерны эндоплазматической сети.

V.3. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РАСТВОРИМЫХ СЕКРЕТИРУЕМЫХ И ЛИЗОСОМНЫХ БЕЛКОВ

Несколько по-другому происходит концентрирование растворимых секретируемых белков или проферментов лизосом, предназначенных для переноса в лизосомы. Как же достигается концентрирования растворимых белков, предназначенных на экспорт из эндоплазматической сети?

Секретируемые белки и ферменты лизосом имеют сигнальную последовательность, которая отрезается при проходе цепи аминокислот через мембрану эндоплазматической сети. Затем растворимые белки либо получают свои моносахаридные цепочки, либо нет и свертываются в глобулярные или овоидные структуры так, чтобы убрать внутрь гидрофобные аминокислоты и обеспечить наиболее оптимальное выполнение функции данным белком. После контроля правильности упаковки они получают возможность выйти из эндоплазматической сети.

Как и в случае мембранных белков, секретируемые просветные белки могут концентрироварться на уровне выходов из эндоплазматической сети или на уровне аппарата Гольджи. Например, такие как белки, секретируемые клетками печени альбумин и альфа-анти-трипсин, не концентрируются существенным образом на уровне выходов из эндоплазматической сети, но концентрируются во время прохода через аппарат Гольджи. Напротив, белки амилаза или химотрипсиноген концентрируются как на уровне выхода из цитоплазматической сети, так и на уровне аппарата Гольджи.

Концентрирование секретируемых белков и предшественников ферментов лизосом основано на особенностях физико-химических свойств данных белков. Суть концентрационного механизма с помощью закисления раствора можно проиллюстрировать, если вспомнить, как устроен белок. Как известно, белок состоит не только из нейтральных аминокислот, но также из большого количества аминокислот несущих отрицательный или положительный заряд в водной среде. Если в среду добавить избыток протонов, то некоторое время рН среды меняться не будет, поскольку избыток протонов вначале будет поглощаться отрицательными зарядами белка, которые тем самым нейтрализуются. Именно поэтому белки обладают свойствами буфера.

Разные белки имеют разное содержание аминокислот, которые содержат щелочные и кислотные группировки. Если в цепи больше аминокислот со щелочными группировками, то белок имеет свойства щелочи, если больше аминокислот с кислотными группировками, то белок имеет свойства кислоты. Гистоны очень щелочные белки, поэтому они и прочно связываются с нуклеиновыми кислотами. Напротив, большая часть цитоплазматических белков имеет кислотный характер. Эту разницу использует клетка для концентрирования данных белков в переносчиках, которые функционируют на участке трассы эндоплазматическая сеть — пластинчатый аппарат Гольджи.

Нейтрализованные белки могут агрегироваться в растворе с низким рН. Другим механизмом концентрирования может быть кальций, концентрация которого в эндоплазматической сети и особенно в просвете цистерн аппарата Гольджи существенно повышена. В таком случае, концентрирование белков на выходе из эндоплазматической сети может быть легко объяснено с помощью концентрирования мембранных белков-насосов протонов в местах выходов из эндоплазматической сети. Поскольку каждый данный белок имеет свое значение pI, точки при которой он становится нейтральным, то можно предположить, что разные белки имеют разную чувствительность к разным значением рН. Одни начинают агрегировать уже при минимальном закислении раствора, другие требуют более значительного снижения рН.

Начальная стадия концентрирования белков в соответствии с механизмом рН-зависимого агрегирования происходит в специальных участках эндоплазматической сети, расположенных рядом с трубчатыми сплетениями или непосредственно в них. В этих зонах с помощью коатомера-2 концентрируются белки-переносчики протонов. Коатомер-2 выполняет поэтому не только функцию концентратора мембранных белков (двоек-диметров или троек-тримеров), но и участвует в концентрировании в зоне выходных мест также таким белков, как ионные насосы.

С помощью энергии макроэргов протоны накачиваются этими белками-насосами в просвет данного участка эндоплазматической сети. Если же в зоне выхода из эндоплазматической сети поставить насос, который прокачивает ионы водорода из цитоплазмы в просвет вакуоли, то в просвете вакуоли будет чуть большая кислотность. Поэтому белки, содержащие больше кислотных остатков, будут здесь осаждаться, то есть концентрироваться, особенно если вход в зону с кислой средой очень узкий и пропускающий только белки в мономерной форме и не пропускающий их, если они образуют более крупные агрегаты. Например, альбумин, наиболее распространенный белок крови, имеет тенденцию к агрегации в кислой среде и он поэтому концентрируется в дисках пластинчатого аппарата Гольджи. То же самое происходит с коллагеном, основным белком соединительной ткани.

Закисление среды ведет к снижению отрицательного заряда секретируемых белков и их агрегации в просвете данного сегмента цистерны эндоплазматической сети или трубчатого сплетения. Затем данный участок вычленяется из цистерны эндоплазматической сети и превращается в переносчик готовый к транспорту по направлению к аппарату Гольджи. Экспортируемый белок оказывается в почти готовых мембранных переносчиках, вагончиках, которые затем должны доставляться к пластинчатому аппарату Гольджи.

Итак, на уровне мест выхода происходит коатомер-2 зависимое прямое концентрирование мембранных белков и непрямое, с участием ионных насосов, концентрирование некоторых растворимых белков. Часть белков на местах выхода не концентрируется, они концентрируются уже в области пластинчатого комплекса. Концентрация экспортируемых белков внутри переносчиков имеет большой биологический смысл — концентрирование мембранных белков в переносчиках резко увеличивает эффективность транспорта и позволяет клетке не возить воду.

V.4. ВЫХОД ИЗ ЭР

Итак, мы оставили наш созревающий переносчик-вагончик, который содержал повышенную концентрацию растворимых и мембранных белков, около выхода из эндоплазматической сети. После того, как экспортируемый белок сконцентрируется в области выхода из эндоплазматической сети, образуются зрелые переносчики. Они имеют форму либо дисков, либо уплощенных цилиндров неправильной формы. Их особенностью является большая, чем в других вакуолях остальной эндоплазматической сети, концентрация экспортируемых белков. Кроме того в переносчиках происходит концентрирование белков СНАРЕ, ответственных за слияния органелл секреторного пути. После завершения созревания переносчика от него отщепляется коатомерное-2 покрытие. После концентрирования и созревания наш переносчик готов к отправке в сторону аппарата Гольджи.

Если пластинчатый аппарат Гольджи располагается недалеко от созревшего переносчика, то велика вероятность, что расположенные на переносчике и на ближайшей части дисков пластинчатого комплекса белки СНАРЕ дотронутся друг до друга во время их свободной диффузии и склеятся. После этого начинается скручивания этих четырех молекул, образующих так называемый комплекс СНАРЕ (см. ниже). Если же аппарат Гольджи располагается в центре клетки, а переносчики формируются на периферии, то требуется централизация переносчиков. Для этого клетка имеет специальные механизмы.

В области аппарата Гольджи имеется особое трехмерное сплетение, образованное из анастомозирующих между собой трубок. Когда аппарат Гольджи отдыхает, данное трубчатое сплетение отсоединяется от стопки дисков, напротив, когда пластинчатый комплекс активно функционирует, то часть тубулярного сплетения становится плоской и в виде резко перфорированного диска приклеивается к начальному (цис) полюсу стопки дисков. Данное трубчатое сплетение содержит внедренные в свою мембрану моторные белки: кинезин и динеин. Первый, используя энергию гидролиза АТФ, может двигаться по микротрубочкам от центра к периферии. Второй, используя тот же принцип, может двигаться наоборот, от периферии к центру. Для того, чтобы осуществить централизацию вагончиков, то есть доставить белок к центру клетки, необходимо какое-то мембранное слияние.

Используя этот моторный белок, кинезин трубчатое сплетение, расположенное в начала пластинчатого комплекса (так называемая сеть на цис стороне), посылает трубчатые выросты в сторону созревшего переносчика. Эти трубки на своем слепом конце содержат увеличенную концентрацию СНАРЕ. Попадая в переносчик, который расположен, как правило, около микротрубочки, растущие мембранные трубки сливаются с ним и тем самым доставляют на его мембрану динеин. Теперь динеин активируется на мембране переносчика и тащит переносчик по направлению к пластинчатому комплексу, как бы шагая по микротрубочке с помощью энергии АТФ.

Постепенное созревание переносчика на эндоплазматической сети может приводить к тому, что он присоединяет к своей мембране специальный белковый комплекс, включающий моторный белок динеин, который с участием гидролиза АТФ быстро перемещает мембранный переносчик вдоль микротрубочки по направлению к центросоме, вокруг которой расположен пластинчатый комплекс. При этом связь переносчика с цистерной эндоплазматической сети может не прерываться, что ведет к вытягиванию вслед за данной органеллой тонкой мембранной трубочки эндоплазматической сети, которая может существовать какое-то время и после прибытия переносчика к аппарату Гольджи. Это объясняет, почему в ряде работ обнаружена прямая мембранная связь между эндоплазматическим ретикулумом и пластинчатым комплексом. На сверхбыстро замороженных, а затем замещенных в замороженном состоянии клетках были убедительно продемонстрированы непрерывные соединения между эндоплазматическим ретикулумом и пластинчатым комплексом.

Скорость перемещения переносчиков от эндоплазматической сети к АГ составляет около 1 мкм/с, причем перемещение часто осуществляется возвратно-поступательно с преобладанием суммарного перемещения к аппарату Гольджи. Прибыв к АГ, переносчик сливается с цистернами средней части этого пластинчатого комплекса. Тем самым переносчик доставляется к пластинчатому комплексу. Здесь он сливается с самым начальным (ближе к цис стороне) диском. Слияние обеспечивается тем фактом, что переносчик содержит увеличенную концентрацию белков СНАРЕ.

V.5. СОВРЕМЕННАЯ МОДЕЛЬ ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ЧЕРЕЗ АГ

Сформированный переносчик сливается с трубчатой сетью, расположенной на цис-стороне стопки пластинчатого комплекса и оказывается включенным в состав этой сети. После слияния с другими мембранами цис-сплетения, экспортируемые белки оказываются в цис-тубулярное сплетении. Тем самым переносчик оказывается соединенным с двумя первыми цистернами Гольджиевой стопки цистерн. При этом в составе цис-тубулярного сплетения можно обнаружить два мембранных участка. В одном концентрируется секретируемый белок или мембранных экспортируемый белок, в другом этих белков нет и находятся там белки отдела, что расположен перед аппаратом Гольджи. После того, как происходит слияние мембранного домена, содержащего секретируемый или экспортируемый белок с цистернами среднего отдела Гольджи, происходит выход ионов кальция из рядом лежащих цистерн эндоплазматической сети и из мешочков аппарата Гольджи.

Следующим этапом транспорта является слияние мембранного домена, заполненного переносимыми белками, с так называемым средним отделом аппарата Гольджи. Когда вагончик, нагруженный экспортируемыми из эндоплазматической сети белками, оказывается полностью созревшим, требуется механизм, который бы его доставил к пластинчатому комплексу Гольджи. Если в клетке нет слияния стопок в единую ленту аппарата Гольджи, то обычно стопки пластинчатого комплекса располагаются в непосредственной близости от выходов из эндоплазматической сети. И для того, чтобы доставить вагончики к пластинчатому комплексу требуется наличие только белков, которые сближают мембраны друг с другом до такого малого расстояния, когда ионы кальция, соединяясь с заряженными головками липидов, вызывают слияние двух мембран. Эти белки называются СНАРЕ, я не буду здесь расшифровывать, почему они названы так, а не иначе, отмечу лишь, что для того, чтобы данные белки смогли осуществлять свою функцию, в мембрану одной органеллы должен был быть внедрен один из 4 белков, образующих функциональный комплекс, белок, который носит название Р-СНАРЕ. Остальные 3 белка (они называются Кью-СНАРЕ) должны быть сконцентрированы на другой из двух органелл, подвергающихся слиянию. Чем выше по эволюционной лестнице стоит организм, тем большее количество таких белковых квартетов существует в клетках. Если в дрожжах имеется только 6 или 7 таких квартетов, то у человека их число более 15.

Один из концов данных СНАРЕ-белков внедрен в липидный бислой мембраны, а другой свободно свисает в цитоплазму, простираясь на расстояние нескольких десятков нанометров. Когда свободный конец одного Р-СНАРЕ касается свободного конца сплетения из трех Кью-СНАРЕ, то они выстраиваются параллельно дуг другу, так, что свободные концы находятся на одной стороне, а заякоренные в мембрану концы — на другой. Затем они начинают скручиваться друг вокруг друга, образуя плотный перекрученный жгут. Тем самым заякоренные концы сближаются друг с другом. Поскольку выдергивание этих белков из мембраны энергетически невыгодно, то органеллы следуют за заякоренными концами белков и органеллы сближаются. Теперь достаточно небольшого увеличения концентрации ионов кальция для того, чтобы он связал две отрицательно заряженные головки молекул липидов из противостоящих органелл для того, чтобы органеллы слились друг с другом.

После доставки белка в пластинчатый комплекс Гольджи, так он подвергается дальнейшей модификации. Отдельные моносахара отрезаются от разветвленной начальной цепочки, полученной белком в эндоплазматической сети. Затем сахаридная цепь удлиняется за счет работы ферментов гликозидаз и гликотрансфераз, то есть ферментов, присоединяющих моносахара. Эти ферменты расположены в пластинчатом комплексе. Когда на конце сахаридной цепи оказываются сиалиловая кислота или моносахар, имеющий название фукоза, белок выходит из пластинчатого комплекса.

Как это происходит? Первым этапом является восстановление способности мембран Гольджи сливаться друг с другом, в частности способности к слиянию между мембранным доменом, заполненным транспортируемыми белками и цистернами срединного отдела. В условиях, когда транспорт через пластинчатый комплекс блокирован, равновесие между процессом образования КОП1 везикул и их слияния с цистернами пластинчатого комплекса сдвигается со стороны большего образования КОП1 везикул.

Пузырьки, образующиеся в результате активности коатомера-1, концентрируют в своем составе мембрин и ГОС28, два белка из СНАРЕ комплексов (которые оперируют на уровне аппарата Гольджи), принадлежащих к группе Qb. Удаление двух этих белков делает набор СНАРЕ, остающихся на цистернах, неадекватным для формирования СНАРЕ комплекса, а значит для слияния мембран. Напомним (см. выше), что любой СНАРЕ комплекс должен включать с себя 4 спиральные цепи, одну с аргинином в центре, а три других разного веса, но с глютамином в центре. Отсутствие хотя бы одной цепи делает формирование СНАРЕ комплекса невозможным и, следовательно, блокирует слияние мембран.