Лысенко был прав!: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

После того как полипептидная цепь оказывается в просвете эндоплазматической сети, соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Фермент узнает точку расщепления в составе специфической N-концевой последовательности белка.

II.18. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ

Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Однако в мембранных белках, в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных последовательностей, которые образованы из 17–26 (иногда больше) гидрофобных, то есть не имеющих полярных групп, аминокислот. Как правило, подобные гидрофобные участки по краям окружены одной или двумя основными (аргинин, лизин или гистидин) или кислотными аминокислотами, содержащими боковые кислотные группы (аспарагиновая или глютаминовая кислоты). Основные кислоты обычно расположены со стороны цитоплазмы, а кислые остатки со стороны просвета эндоплазматической сети.

Когда данная часть аминокислотной цепи оказывается внутри гидрофильного белкового канала, возникает необходимость вытолкнуть из гидрофильной зоны канала гидрофобную скрученную цепь аминокислот. Канал раскрывается и гидрофобный скрученный участок оказывается внутри липидного бислоя.

При этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число альфа-спиральных "заякоревающих" участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок, который переносит молекулу глюкозы через мембрану, имеет 12 таких гидрофобных участков. Похожим образом оказываются в просвете цистерны эндоплазматической сети проферменты лизосом, которые переносятся к лизосомам и по ходу дела от них отщепляется пропептид и они превращаются в лизосомные ферменты-гидролазы.

В этом случае аминокислотная цепь остается погруженной в мембрану и дает начало интегральному мембранному белку. В ходе белкового синтеза возможно многократное прохождение растущей цепи через мембрану и возобновление синтеза вновь при посредстве сигнального пептида. Образующийся по такому механизму мембранный белок будет иметь множество участков, погруженных в мембранный бислой.

Внутри полости эндоплазматической сети с помощью фермента (сигнальной пептидазы) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости эндоплазматической сети и в это время рибосома отделяется от транслокона и диссоциирует. После этого в транслоконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цепи происходит ее связь с олигосахаридами (гликозилирование — см. ниже). В полости цистерн эндоплазматической сети белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфидные связи, происходит их правильное сворачивание, происходит сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией (пространственной упаковкой) в дальнейшем будут переноситься в зону аппарата Гольджи.

II.19. КАК КЛЕТКА РАЗРУШАЕТ ОДИНОЧНЫЕ И ДВОЙНЫЕ ЦЕПИ РНК?

Если бы мРНК не подвергалась разрушению, клетка бы не могла оперативно реагировать на изменяющиеся условия среды активацией синтеза нужных в данный момент белков. Поэтому для мРНК характерно короткое время жизни, так как они быстро распадаются после трансляции. Молекула мРНК живет от 10 мин до 2 суток. Особенно короткоживущими являются мРНК регуляторных белков. Они разрушаются РНК-азами (белками, режущими РНК на отдельные нуклеотиды) в цитоплазме. Итак, длинная мРНК, не образующая петель и шпилек, разрушается с концов под действием РНК-аз. Выраженность всех этих механизмов по разрезанию РНК определяет насколько долго существует данная мРНК в цитоплазме и как быстро она разрушается.

Источниками двухцепотчатых молекул РНК являются тРНК, рРНК и сРНК, двойные цепи РНК возможно в виде шпилечных структур на незрелой молекуле мРНК при мутациях или при введении в клетку коротких комплементарных цепей РНК для интерферирования с мРНК выбранного белка. Это могут быть также искусственно введённые в клетку молекулы РНК. Источник двуцепочечных РНК в клетке может быть и другим: активность клеточной или вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, синтезирующей незрелые мРНК, которые способны к внутримолекулярному склеиванию …

Для разрушения двойных цепей РНК, имеющихся или образующихся к клетке, имеются специальные белковые машины. Появление в цитоплазме двуцепочечной РНК из-за склеивания мРНК, а также повреждения и вследствие этого выпадение из белково-нуклеиновых комплексов рРНК, тРНК или сРНК запускает специальную белковую машину, приспособленную для разрезания таких двойных РНК. Когда любая короткая цепь РНК, имеющая комплементарность по отношению к одному из участков мРНК, склеивается с ней, то она тоже попадает в тот же самый метаболический путь, что и обычно существующие двойные РНК.

II.20. РАЗРЕЗАНИЕ ДВОЙНЫХ ЦЕПЕЙ РНК

Незрелые мРНК генов, у которых имеются участки, способные к склеиванию, образуют склейки в форме шпилек уже в ядре. Эти "шпильки" РНК могут отрезаться от незрелой мРНК также уже в ядре, где от таких незрелых мРНК отрезаются получающиеся в результате такой склейки шпильки или структуры в виде стебелька или петли длиной около 70 нуклеотидов. Пока белковые машины, ответственные за этот процесс и способные проникать в ядро, не выявлены.

Для того, чтобы разрушать ненужные двухцепотчатые РНК, в цитоплазме подавляющего большинства клеток имеется специальный фермент, обладающий рибонуклеазной активностью. Это белок-фермент Дайсер (Dicer). Белок Дайсер связывается лишь с длинными двуцепочечными РНК. Он связывает и разрезает длинные двойные нити РНК на короткие двухцепочечные фрагменты длиной 21–25 пар нуклеотидов, с несколькими неспаренными нуклеотидами на каждом конце. Одна из двух цепей каждого получившегося фрагмента называется ведущей цепью.

Белок Дайсер регулируется другими белками, которые могут усиливать или угнетать его каталитическую активность. Дайсеру помогают в этом особые белки со странными названиями Дроша и Паша.

В растениях система белков, направленная на разрезания и затем деградацию двухцепотчатых РНК, выражена гораздо лучше, чем у животных, так как в растениях опасности получения двойных цепей РНК при перемещении мРНК мутантных белков по плазмодесмам выражены гораздо выше.

Разделение двух цепей коротких (20–25 пар нуклеотидов) двойных цепей ДНК происходит белковым комплексом, который носит название РИСК (RNA-induced silencing complex, RISC). Короткая двойная молекула РНК далее поступает в RISC РИСК независимо от того, где она синтезирована в ядре или вне клетки.

Короткие фрагменты двойной РНК захватываются РИСК-ом и разделяются на одиночные цепи, которые уже затем разрушаются обычными РНК-азами. Разделение цепей короткой двойной молекулы РНК является АТФ-независимым и осуществляется непосредственно белками, входящими в состав RISC.

После интеграции в РИСК короткие двойные цепи РНК разделяются и комплементарно соединяются с мРНК-мишенью. В результате одноцепочечный фрагмент РНК склеивается с комплементарной последовательностью молекулы мРНК.

Каталитической частью РИСКа являются белки-эндонуклеазы семейства Аргонавт (Argonaute), которые разрезают мРНК. Фрагменты, которые образуются после разрезания белком Дайсером, являются двухцепочечными. Потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК. Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой, связывается с белком Аrgonaute и вызывает сайленсинг гена.

Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей, подвергается деградации.

У эукариот белки Аргонавты обнаружены в высоких концентрациях в районах цитоплазмы клеток, известных как Р-тельца, цитоплазматические тельца, в которых разрушаются мРНК Семейство белков Аргонавт очень древнее. Эти белки есть не только у эукариот, но и у некоторых архей и даже бактерий, что свидетельствует о том, что проблема удаления двойных цепей РНК существовала с незапамятных времен (217)

II.21. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

Свойство нуклеиновых кислот образовывать склейки (интерферировать или подвергаться межмолекулярной гибридизации) если последовательности нуклеотидов комплементарны друг другу было использовано в науке одним из первых.

В цитологии, гистологии и патологической анатомии широко применяется так метод так называемой гибридизации ин ситу (in situ). Суть его в том, что если исследователь знает последовательность нуклеотидов в каком-то участке гена, то можно определить положение данного гена в пределах хромосомы. Кроме того путем измерения количества мРНК, синтезированной на основе информации, которая записана в данном гене, можно количественно выявить, на каких генах происходит процесс транскрипции (синтеза молекул РНК на базе комплементарной ДНК) в данной клетке (75).

Гибридизации нуклеиновых кислот используется для мечения ДНК и РНК с помощью видимых в микроскопе маркеров. При этом гибридизация используется для мечения особых последовательностей ДНК и РНК. Если РНК являясь одноцепотчатой доступна для мечения сразу, то для того, чтобы сделать ДНК доступной для гибридизации и мечения надо ее нагреть, чтобы двойная цепь ДНК разошлась на одиночные цепочки.

Для этого ученые синтезируют короткие цепочки ДНК или РНК, комплементарные гену или его мРНК. Затем берутся образцы тканей или органов и готовятся гистологические или электронно-микроскопические срезы. Затем срезы нагреваются.

При этом цепи ДНК из-за резкого увеличения подвижности молекул разрывают водородные связи и расплетаются, превращаясь в одиночные. Они становятся доступными для склеивания с короткими одиночными цепями ДНК, добавляемых к срезу извне. Если срез охладить после добавления, то короткие цепи конкурируют с комплементарными цепями ДНК за места склеивания и гораздо успешнее, чем длинные молекулы, приклеиваются (интерферируют или подвергаются гибридизации) к комплементарным участкам расплетенной молекулы ДНК. Короткие цепи имеют тенденцию приклеиваться к комплементарным участкам. Если участки менее комплементарны, чем длинная комплементарная нить ДНК, то короткие цепи хуже склеиваются и проигрывают соревнование за места склеивания.

Метод осуществляется таким образом — сначала срезы нагревают до температуры плавления ДНК (это температура, при которой происходит отклеивание двух нитей ДНК друг от друга, обычно около 90 °C), затем при чуть более низкой температуре добавляют наш зонд в виде короткой одиночной цепи ДНК, которая мечена либо с помощью внедрения в молекулу радиоактивного изотопа либо путем химического пришивания к цепи нуклеотидов вещества, которое испускает под воздействием света с короткой длиной волны фотоны света с более длинной волной (возникает так называемая флюоресценция). Измеряя радиоактивность в экспериментальных и контрольных образцах, подготовленных абсолютно одинаково, можно судить количественно о том, какие гены есть в данных клетках. Если вместо короткой нити ДНК использовать короткую комлементарную и меченную нить РНК, то можно измерить уровень транскрипции с данного гена.

Введение метода ДНК-ДНК гибридизации позволило доказать, что микоплазмы (самые примитивные бактерии) являются самостоятельной группой, получившей название класс Mollicutes (216).