ДНК и её человек: читать начало книги онлайн

В сентябре Кэри поставил первый опыт с геном фактора роста нервов: добавил в пробирку с человеческой ДНК праймеры и полимеразу и оставил ее на 12 часов. Но когда он провел электрофорез, никакой полосы, соответствующей фрагменту длиной 400 нуклеотидов, не появилось.

Пришлось признать, что реакция не будет совсем уж простой. Дело в том, что двунитевая ДНК распадается на две свободные нити при определенной температуре (94–95° С), а комплементарные нити слипаются, подобно половинкам застежки-молнии, при низкой (желательно не выше 68° С). Для описания этих процессов молекулярные биологи заимствовали термины из металлургии, двунитевая ДНК у них “плавится”, коротенькие праймеры “отжигаются” на свободную нить[29].

Конечно, живая клетка не должна нагреваться и остывать каждый раз, как захочет копировать свою ДНК, – в клетке расплетание и заплетание двойной спирали обеспечивают специальные белки. Но в пробирке проще действовать чистой физикой, чем добавлять все эти белки.

Соответственно, цикл усложняется: нагреть раствор с образцом ДНК – добавить праймеры – охладить пробирку – добавить ДНК-полимеразу – провести реакцию – нагреть пробирку – охладить пробирку и добавить новую полимеразу, потому что старая сварилась при нагреве и потеряла активность – провести реакцию… Чуть больше возни, но ради великой цели можно и повозиться.

В этот момент отношения Кэри и Дженнифер окончательно испортились, и научные успехи его мало радовали. Первый удачный эксперимент состоялся лишь 16 декабря 1983 г. На этот раз Муллис поставил себе более скромную задачу: амплифицировать определенный участок плазмиды pBR322, привычного инструмента молекулярщиков. И все получилось.

В 1985 г., отшлифовав метод, Муллис отправил статью о нем в Nature. Этой статье не так повезло, как той его дебютной, про обратное течение времени, – она не была опубликована. Рецензенты нашли ее чисто технической и неоригинальной. Публикация в Science состоялась, хотя и не с первого захода. Было даже так: в 1985 г. вышла статья сотрудников Cetus, с Муллисом в середине списка соавторов, о применении ПЦР для исследования гена бета-глобина на предмет поиска мутаций, приводящих к серповидноклеточной анемии[30]. Статья собственно про ПЦР – про ПЦР как метод амплификации ДНК – увидела свет в 1988 г.[31]

К тому времени полимеразная реакция уже вышла в публичное пространство – после того, как у Муллиса появилась возможность представить ПЦР на майском симпозиуме 1986 г. в знаменитой лаборатории Колд-Спринг-Харбор. Реакция научного сообщества была быстрой и впечатляющей. Cetus начала получать множество запросов о PCR, это заставило руководство внимательнее присмотреться к выдумкам Муллиса и изучить возможности дальнейшего развития технологии. Компания позволила автору посвятить все время совершенствованию ПЦР и, когда он добился успеха, наградила его беспрецедентно большим бонусом в $10 000. Позднее Cetus продала патент на ПЦР за $330 млн компании Hoffmann-La Roche. Говорили ему умные люди… Правда, сама Cetus примерно в то же время прекратила существование, в июле 1991 г. было объявлено о ее слиянии с биотехнологической компанией Chiron. Юридическая часть истории на этом не заканчивается, там еще много интересного[32]. Права на метод в итоге принадлежат Hoffmann-La Roche и ее “дочке” Roche Molecular Systems, у них более тысячи патентов и заявок, так или иначе связанных с ПЦР.

Научное сообщество воздало должное Кэри Муллису. В 1989 г. Science объявил полимеразу “молекулой года”. В 1993 г. Муллису за изобретение ПЦР была присуждена Нобелевская премия. Десять лет с той ночи на трассе, пять лет с публикации – можно сказать, высшее признание пришло практически мгновенно! Лекцию новоиспеченный нобелиат прочел ироничную, местами провокационную, как и следовало ожидать, и всячески подчеркивал, что успех ПЦР в то время очень мало вознаградил его за потерю Дженнифер, “этой прекрасной, сумасшедшей женщины-химика”.

Компанию Cetus Муллис покинул еще в 1986 г., недовольный обращением с ним и с другими сотрудниками в группе ПЦР, – с выходным пособием в размере зарплаты за пять месяцев. Занимался он с тех пор многим, но, как правило, “избегал занудства”, используя выражение Джима Уотсона. И это мягко сказано.

Муллиса вспоминают все журналисты, которым надо рассказать о том, какими странными бывают нобелевские лауреаты. Он публично заявлял, например, что причина СПИДа – вовсе не вирус иммунодефицита человека, по крайней мере не только вирус. Он отрицал изменение климата на Земле; обозвал социологию “бесполезной наукой” за то, что она не желает считаться с астрологическими прогнозами. Муллис не скрывает, что в молодости принимал ЛСД, подчеркивает, что это было обычной практикой в то время и что этот опыт дал ему “больше, чем любые курсы”. Впрочем, как он особо отмечает, он не был под веществами, когда в 1985 г. повстречал в лесу зеленого светящегося енота – посланца инопланетян. Говорит он и более возмутительные вещи – например, о том, как вредны для науки приверженность догмам, грантовая система и попытки коммерциализации.

Его автобиография называется “Танцуя нагишом на поле разума” (Dancing Naked in the Mind Field)[33]. Не удержусь от короткой цитаты: “Нам повезло, что в нашем детстве русские были врагами. Мы тренировались прятаться под партами на тот случай, если бы они осмелились сбросить ядерную бомбу на Колумбию, Южная Каролина, во время уроков. В 1957 году русские запустили космическую гонку, отправив Спутник I на орбиту вокруг Земли. Он был всего двадцати трех дюймов в диаметре, но это революционизировало американскую образовательную систему. Правительство влило миллионы долларов в научное образование. Это было удачное время, чтобы быть молодым и влюбленным в науку”. Рассуждение вполне в духе Кэри Муллиса. Наверное, так говорить нехорошо – “повезло, что были врагами”. Надо бы придумать другие способы, побуждающие правительство вливать миллионы в научное образование.

После ухода из Cetus Муллис два года проработал директором по молекулярной биологии компании Xytronyx. Выступал консультантом по научным вопросам, в том числе и на судебных процессах[34]. В 1992 г. основал бизнес по продаже украшений, содержащих амплифицированную ДНК покойных знаменитостей – Элвиса Пресли, Мэрилин Монро. С 2003 г. по настоящее время он руководит созданной им компанией Altermune LLC. Компания планирует реализовать оригинальную идею: вызывать у организма иммунный ответ против определенного вещества (которое вызывает иммунный ответ всегда) и с помощью особых молекул-адапторов перенаправлять этот ответ на патоген, который надо уничтожить[35],[36]. Удачи ему – а мы продолжим об амплификации ДНК.

Итак, какие возможности принесла в молекулярную биологию полимеразная реакция с двумя праймерами?

“Аналитики склонились к приборам ПЦР…”

Прежде всего – медицина, как и хотел Кэри Муллис. Сам он на своем сайте ядовито заметил, что “на медицину ПЦР повлияла намного меньше, чем на медицинскую журналистику”[37], но тут он не совсем прав.

Чего стоит хотя бы применение в диагностических целях, быстрый и легкий анализ на инфекционные агенты. На заре микробиологии для этого был создан фенотипический метод: образцы, взятые у больного, высевали на питательную среду, смотрели, что вырастет, определяли бактерий, окрашивая их различными красителями и затем изучая под микроскопом. Настоящее искусство! Затем появились иммунологические методы, так или иначе использующие антитела – молекулы иммунной системы, в своем роде не менее удивительные, чем ДНК, способные избирательно взаимодействовать с одним и только одним чужеродным веществом (например, поверхностным белком бактерий). Но полимеразная цепная реакция все упростила: берешь образец, выделяешь тотальную ДНК или просто разрушаешь клетки и прочие структуры, чтобы ДНК стала доступной, добавляешь полимеразу и праймеры, комплементарные определенным участкам генома бактерии или вируса, по которым определяют вид и штамм, – и вперед.

Если в образце есть хотя бы следовые количества ДНК возбудителя болезни, в нем пойдет полимеразная реакция. Современные методы даже позволяют с помощью ПЦР количественно определять ДНК вируса или бактерии – узнать не только то, есть ли в образце клостридия или туберкулезная палочка, но и много ее или мало. Это называется “полимеразная цепная реакция в реальном времени”: количество синтезированной ДНК в образце определяют непосредственно в каждом цикле и строят график вроде тех, что показаны на рисунке. (На плато он выходит, потому что в реальной жизни ничто не может умножаться бесконечно – реагенты кончаются.) Многие вирусы имеют РНК-геном, но и на них есть свои приемы: ни одна зараза от ПЦР не укроется.

Однако для этого надо знать возбудителя заранее – знать, кого мы ищем. Ведь чтобы провести ПЦР, нужны праймеры, комплементарные его и только его геному. С тех пор как секвенирование продвинулось вперед и геномы медицински значимых микроорганизмов (а потом и всех других) стали читать полностью, принципиальной проблемы в этом нет. Но тут важно не сделать ошибки, не получить ложноположительного результата, если праймер прилипнет к ДНК какой-нибудь безобидной бактерии. То есть ответственность за результат с лабораторными диагностами теперь разделяют биоинформатики.

Интересно, что многие люди, которые слышали о ПЦР, но не до конца разобрались в том, как она работает, приписывают ей почти магическую силу. Вот, например, роман Дэна Брауна “Инферно”. Очередной злой гений, противостоящий профессору Лэнгдону, изобретает инфекцию, которая должна сократить численность человечества. Гений, в общем-то, не такой уж злой, он беспокоится о том, чтобы перенаселение Земли не сгубило культуру, цивилизацию и гуманизм, но предложенный им метод почему-то не нравится ни частным лицам, ни правительственным организациям, и действие крутится вокруг поиска биологической бомбы с возбудителем. Несколько раз с особым ударением подчеркнуто, что никто не знает, что это за возбудитель, даже с точностью “вирус или бактерия”. А может быть, не то и не другое, а новая форма жизни, потому что злодей гениален.

После многих приключений и разгадывания искусствоведческих шарад силы добра находят место, откуда уже вырвалась или вот-вот должна вырваться страшная инфекция. Место это в уютной пещере, посещаемой туристами, в подземном озере. Далее цитата.

Спрашивается: откуда у чиновников ВОЗ специфические праймеры к абсолютно неизвестному, супертаинственному возбудителю? Настолько специфические, что сразу ясно, с одного красного огонечка: он самый, и мы все умрем? Можно, конечно, использовать праймеры к консервативным участкам, которые встречаются в геномах многих вирусов (пусть будет вирус, а не бактерия). Тогда мы получим сигнал, если в пробе присутствует любой из этих вирусов. Однако неудивительно, что в месте, где постоянно ходят толпы сопливых туристов, есть какие-то вирусы. Да, в воде их немного, но в том и прелесть ПЦР, что она делает различимый сигнал из следовых количеств нуклеиновых кислот. Так что, похоже, обманывали профессора Лэнгдона не только симпатичные девушки и тайные агенты. Всемирная организация здравоохранения сама была в курсе коварного замысла, даже геном возбудителя имела! Или автор чего-то не понял про ПЦР. Зато он много знает об истории искусства, в отличие, например, от меня.

Вот такое у ПЦР граничное условие: знать фланкирующие последовательности, то есть конец и начало интересующего участка. И в конце ХХ в., когда читали геном человека, фрагменты клонировали в векторах (сотрудники Крейга Вентера, которые работали с короткими фрагментами, – даже в обычных бактериальных плазмидах). А к последовательностям в векторе уже можно применять ПЦР: даже если вставку никто еще не читал, последовательность плазмиды, в которую она вставлена, известна.

С другой стороны, по мере того как развивается геномика (так назвали раздел науки, которая изучает уже не только отдельные гены, но целые геномы), нечитанных последовательностей в природе все меньше. Теперь ПЦР нашла применение и в палеогеномике. Если мы знаем, какому зверю (или человеку, брату Homo sapiens) принадлежит ископаемая кость, можно синтезировать праймеры, основываясь на геноме родственного вида.

И даже если мы этого не знаем – все равно можно попробовать. Гены, кодирующие рибосомную РНК, имеются у всего живого, при этом эволюция вносит в них изменения крайне осторожно и деликатно. Рибосомы – те самые штуки, которые синтезируют белки, и слишком смелые инновации в рибосомных генах могут привести к потере этой крайне необходимой для жизни способности. Поэтому можно вытянуть с помощью ПЦР рибосомный ген неизвестного существа и, сравнив его с известными последовательностями других существ, сделать довольно точные выводы о том, на какой веточке эволюционного древа сидел тот, кому принадлежала кость.

Полимеразная цепная реакция позволяет “снимать копии” с крайне малого количества ДНК – сотен, а то и десятков пикограммов, то есть геномов горсточки клеток. Из считанных молекул, содержащихся в образце, можно получить количество, достаточное для анализа. Теперь уликой в уголовном деле может стать и капля крови, и несколько волосков (с волосяными луковицами), а личность убитого можно установить даже по фрагменту кости.

Сегодня существует множество вариантов ПЦР для самых разных надобностей[39]. Можно проводить реакцию с несколькими парами праймеров в одной пробирке, можно амплифицировать фрагменты длиннее 5000 пар нуклеотидов. Хитроумный способ, включающий нарезание исходной ДНК на куски и их закольцовывание, позволяет получить копии последовательности, которая в линейной ДНК была справа и слева от известных праймеров, а не между ними (это нужно, например, чтобы понять, в какое место человеческой ДНК встроил свой геном вирус). Можно запустить полимеразную реакцию внутри целых живых клеток в культуре, а потом с помощью гибридизации показать, где находится искомая нуклеотидная последовательность… Много чего можно. В настоящее время ПЦР – трудолюбивая рабочая лошадка молекулярной биологии, ее гоняют и в хвост и в гриву. Кстати, и большинство методов высокопроизводительного секвенирования с необходимостью включают в себя полимеразную цепную реакцию на этапе подготовки библиотек ДНК-фрагментов. И так будет по крайней мере до тех пор, пока не победят методы, работающие с единичными молекулами, вроде нанопорового секвенирования. То есть еще долго. Нельзя исключать, что на смену классической ПЦР придут другие методы амплификации ДНК – но и они, скорее всего, будут так или иначе использовать принцип, придуманный майской ночью на трассе 128.

Выделить главное

Теперь опять вернемся к человеческой ДНК, Алеку Джеффрису, криминалистике и определению отцовства. Те самые участки с повторяющимися последовательностями, которые Алек Джеффрис в своих первых экспериментах искал среди рестрикционных фрагментов, мы легко можем получить с помощью ПЦР. И на форезе тогда будет не “всеобщая смазь”, какую мы видели в первых опытах, а четкие отдельные полоски.

Мы помним, что одна из самых серьезных проблем ДНК-фингерпринта в криминалистике – малые количества доступной ДНК и высокая вероятность ее деградации в неидеальных условиях места преступления. Эти проблемы помогла решить, во-первых, полимеразная цепная реакция, а во-вторых, выбор других маркеров. Вместо гипервариабельных минисателлитов (VNTR) начали использовать микросателлиты, они же короткие (простые) тандемные повторы, они же STR (short tandem repeat, simple tandem repeat). И по сей день ученые и криминалисты всех цивилизованных стран пользуются стандартными методиками для исследования STR-локусов.

[29] У металлургов отжиг – нагревание металла с последующим охлаждением, изменяющее его структуру и свойства. – Прим. ред.

[30] Saiki R. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985, 230 (4732): 1350–1354. doi: 10.1126/science.2999980.

[31] Saiki R. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988); 239 (4839): 487–491; doi: 10.1126/science.2448875.

[32] Fore J., Wiechers I. R., Cook-Deegan R. The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study // J Biomed Discov Collab. 2006; 1: 7; doi: 10.1186/1747–5333–1–7.

[33] Mullis K. Dancing Naked in the Mind Field. – Vintage Books, 1998. https://www.goodreads.com/book/show/48497.Dancing_Naked_in_the_Mind_Field.

[34] . http://www.karymullis.com/pdf/karymullis-cv.pdf.

[35] Kristian S. A. et al. Retargeting pre-existing human antibodies to a bacterial pathogen with an alpha-Gal conjugated aptamer // J Mol Med (Berl). 2015 Jun; 93 (6): 619–631; doi: 10.1007/s00109–015–1280–4.

[36] Molecular Homing Beacon Redirects Human Antibodies to Fight Pathogenic Bacteria http://ucsdnews.ucsd.edu/pressrelease/molecular_homing_beacon_redirects_human_antibodies_to_fight_pathogenic_bact.

[37] . https://www.karymullis.com/pcr.shtml.

[39] 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция // Биомолекула. https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia.