ДНК и её человек: читать начало книги онлайн

Поглядев на рентгенограммы Розалинд Франклин (особенно важную роль сыграла легендарная “фотография № 51”), Уотсон и Крик выдвинули предположение, что ДНК состоит из двух нитей, соединенных друг с другом азотистыми основаниями и закрученных одна вокруг другой. К 28 февраля 1953 г. Уотсон и Крик уже были уверены в своей правоте; Крик даже заявил в местном пабе, что они “раскрыли секрет жизни”. Их знаменитая статья[9] вышла 25 апреля 1953 г. (таким образом, в 2018 г. человечество отметило 65 лет знакомства с двойной спиралью). Статья заканчивалась горделиво-скромно: “От нашего внимания не ускользнуло, что специфическое взаимодействие, которое мы постулировали, сразу же предоставляет возможный механизм копирования генетического материала”. Действительно, двойная спираль не только соответствовала рентгенограмме, полученной Франклин, но и давала ответ на самый главный вопрос – каким образом информация копируется и передается по наследству!

Теперь два абзаца биохимии, чтобы подвести итог достижениям отцов (и матерей) молекулярной биологии. Постарайтесь это пережить, а кому не хочется – просто посмотрите на рис. 4 (справа) и переходите к следующей главе. Молекула пятиатомного углевода дезоксирибозы в составе ДНК замкнута в цикл, к ней присоединены азотистое основание и фосфат. Атомы углерода в дезоксирибозе пронумерованы, от одного до пяти; цифры помечены штрихами (в отличие от углеродов азотистого основания, которые пронумерованы без штрихов). К 5’ – углероду присоединен “собственный” фосфат нуклеотида, к 3’ – углероду – фосфат другого нуклеотида, соседа по цепочке. По ним названы и концы нуклеотидной цепи – 5’ – и 3’ – конец. “Начало” цепи, ее “левый” конец (мы читаем слева направо, и последовательность нуклеотидов в ДНК нам удобнее записывать таким же образом) – это 5’ – конец. Любая цепочка ДНК (или РНК) растет от 5’ – к 3’ – концу – новый нуклеотидный остаток всегда присоединяется к 3’ – атому.

Азотистые основания – это то, благодаря чему четыре нуклеотида различаются между собой (остатки дезоксирибозы и фосфаты у всех нуклеотидов одинаковые). Два больших, аденин и гуанин (см. рис. 4), называются пуринами, а два маленьких, с одним шестичленным циклом – тимин и цитозин – пиримидинами. Это и есть те самые “буквы” А, Т, G, С, которыми записывается генетическая информация. Что существенно – этими нуклеотидами две цепочки двойной спирали держатся друг за друга. Напротив аденина всегда стоит тимин, а напротив гуанина – цитозин. Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепочке однозначно определяет последовательность нуклеотидов в другой цепочке, что позволяет ДНК копироваться.

Теперь мы знаем, что такое ген!

Следующие десятилетия тоже прошли не зря. Структура молекулы – это прекрасно, однако надо было понять, каким образом ДНК копируется (реплицируется), как записанная в ней информация превращается в признаки.

Наиболее важное и удивительное свойство двойной спирали – это, конечно, заложенная в ее структуре способность к самокопированию. Если разделить две нити, то на каждой можно начать строить ее копию, в итоге получить вместо исходной двойной спирали две одинаковые и по-сестрински разделить их между сестринскими клетками. Или построить на определенном участке ДНК молекулу матричной РНК (мРНК) – инструкцию для синтеза белка. Ура, наконец-то мы узнали, что такое ген – фрагмент ДНК, в котором записана последовательность аминокислот определенного белка, плюс регуляторные участки, через которые происходит включение и выключение гена. (Правда, есть и такие гены, которые кодируют не матричную РНК и через нее белок, а просто РНК, имеющую самостоятельные функции.)

Разобрались с репликацией ДНК, расшифровали генетический код, то есть разгадали, каким образом можно записывать последовательности из 20 аминокислот четырьмя нуклеотидами. Оказалось, природа использует элегантный шифр – каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида; таких комбинаций существует, как нетрудно подсчитать, 64, поэтому одной аминокислоте могут соответствовать несколько триплетов – код вырожденный, как говорят математики.

Стало понятно, что ДНК в ядре клетки – это библиотека, в которой книги не выдают на дом, но позволяют снимать копии и забирать с собой. Или, в современных образах, – магазин электронных книг, который может продать бесконечное количество экземпляров той или иной книги в удобном для чтения формате. Копии книг – это матричные РНК, рибосомы (клеточные машинки для синтеза белка) читают их по триплетам и в соответствии с этими триплетами строят белок. Таким образом, поток информации идет в направлении от ДНК к РНК и затем от РНК к белку. Это и есть центральная догма молекулярной биологии, которую сформулировал Фрэнсис Крик в 1958 г.

Возможно, “догма” не самое подходящее слово. Как писал историк молекулярной биологии Хорас Джадсон в книге “Восьмой день творения” (The Eighth Day of Creation) о своем разговоре с Фрэнсисом Криком: “«Я имел в виду, что догмой называют идею, для которой нет обоснованных подтверждений. Понимаете?!» Крик издал восторженный рев. «Да я просто не знал, что значит «догма»! И мог бы с тем же успехом назвать ее Центральной Гипотезой или как-то в этом роде. Это я и хотел сказать. Догма – только слово-крючок»”. В любом случае сегодня центральная догма “ДНК → РНК → белок” ни у кого не вызывает ни малейших сомнений: обоснованных подтверждений более чем достаточно. Хотя теперь известно, что информация может передаваться от РНК к ДНК (например, в жизненном цикле некоторых вирусов с РНК-геномом), общей картины это не меняет. Магистральный поток информации направлен от ДНК к белкам – строителям и строительным материалам всего живого.

Как читать ДНК

Фредерик Сенгер и его метод секвенирования

Конечно, все захотели читать ДНК – черпать информацию о жизни прямо из источника. Но как читать буквы, если эти буквы – молекулы?

Необходим был удобный метод определения нуклеотидной последовательности, и такие методы стали появляться. Правда, большая часть их сегодня имеет лишь историческую значимость: для нынешних биологов “плюс-минус” секвенирование или “секвенирование по Максаму – Гилберту методом химической деградации” – что-то вроде микроскопа Левенгука.

Слово “секвенирование”, собственно, и означает “определение последовательности” (от англ. sequence); говорят о секвенировании ДНК, РНК, белков. Предложенное в 1970 г. секвенирование по Максаму – Гилберту, если коротко, подразумевало расщепление ДНК в растворах, организованное таким образом, чтобы получались молекулы всех возможных длин. Но это не самый рациональный подход. ДНК – именно та молекула, которая умеет копироваться сама на себе. Если взять у клетки ферменты, которые работают с ДНК, и научиться их использовать в наших целях, можно добиться многого. Почему бы, например, вместо того чтобы нарезать ДНК столькими способами, сколько в ней букв, не нарастить на ней дочерние цепи всех возможных длин? На этой идее основано секвенирование по Сенгеру – метод, также изобретенный в 70-е гг. прошлого века и благополучно доживший до наших дней.

Английский биохимик Фредерик Сенгер (1918–2013) – один из четырех человек, получивших две Нобелевские премии, и единственный, у которого обе – по химии (1958 и 1980 гг.): за определение структуры белка инсулина и за метод секвенирования ДНК. В 1975 г. Сенгер в совместной статье с Аланом Коулсоном представил метод “плюс-минус” секвенирования[10]. С помощью этого метода группа Сенгера почти полностью прочла геном бактериофага φX174 (5386 нуклеотидов) – по тем временам большой успех[11]. Однако все эти достижения затмило секвенирование по Сенгеру методом терминаторов, он же метод обрыва цепи, или дидезоксиметод[12]. Но сначала нужно объяснить, как молекулы ДНК сортируют по размеру с помощью электрофореза.

Мы помним, что ДНК – это кислота. Кислотные свойства определяются остатками фосфорной кислоты в ее составе – фосфатами. Из школьного курса известно, что анионы кислоты заряжены отрицательно: H₃PO₄ → H⁺ + H₂PO₄^– . Поэтому, если через раствор, содержащий ДНК, пропустить ток, молекулы ДНК направятся к положительно заряженному электроду. А если раствор заменить гелем – несъедобным желе, молекулярной сеткой, заполненной жидкостью? Тогда молекулы ДНК не поплывут к плюсу туманным облачком, а каждая станет продвигаться со своей скоростью – чем длиннее молекула, тем труднее ей будет просачиваться через ячейки геля. Если же сделать в геле углубления (лунки) у отрицательного электрода, поместить в них ДНК и включить ток, от минуса к плюсу протянутся дорожки, и в них будут полоски, в каждой – молекулы ДНК определенного размера. Это называется “электрофорез ДНК”, или просто форез.

Теперь можем рассказать, как работает метод Сенгера. Реакционную смесь делят на четыре части. В каждую из четырех добавляют праймер (затравку для синтеза) – короткую молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно секвенировать. Праймер связывается с этим участком, образуя с ним двойную спираль. (Исследуемую ДНК перед этим, конечно, надо “расплести”, сделать однонитевой.) Фермент ДНК-полимераза, используя анализируемую ДНК в качестве матрицы, начинает наращивать праймер, соединяя в цепочку нуклеотиды. К обычным нуклеотидам в реакционной смеси добавлены необычные. Во-первых, некоторые нуклеотиды содержат радиоактивную метку (потом объясню зачем). Во-вторых, в каждой из четырех смесей небольшое количество одного из четырех нуклеотидов модифицировано – лишено OH-группы. К такому нуклеотиду (дидезоксинуклеотиду) нельзя присоединить следующий. А количество подобрано таким образом, чтобы среди новых цепочек были оборванные на каждом аденине – в одной пробирке, тимине – в другой, гуанине – в третьей, на каждом цитозине – в четвертой. И если потом внести реакционные смеси в лунки и провести электрофорез, получатся “лесенки”. Сложно, но станет яснее, если посмотреть на рис. 5 и 6.

Автоматическое распознавание

Как это происходило на практике? О-о… Классическое секвенирование по Сенгеру – процедура, которая у старшего поколения ассоциируется с золотым веком молекулярной биологии, когда было мало простого, покупного и готового и все умели работать руками, не то что сейчас. Не удержусь и расскажу подробнее: я ее еще застала.

Итак, гель нам понадобится не агарозный, как для крупных фрагментов, сильно различающихся по размеру, а полиакриламидный и очень тонкий. Разделить молекулы ДНК, различающиеся всего на один нуклеотид, – серьезная задача. Гель готовим из акриламида (канцероген; распишитесь, студенты, что поняли, а также насчет радиоактивной метки – хоть фосфор-32 и смешной по активности изотоп, но все-таки пить его не надо). Горячую прозрачную жидкость заливаем в пространство между двумя идеально плоскими стеклами размером примерно А3 с зажатыми по краям полосками пластика – спейсерами. Стеклянная струйка сбегает вниз, гель заливается, заливается, залива… черт-черт, пузырь застрял и не всплывает! Подхватываем что-нибудь твердое, вроде ножниц, стучим по стеклу деликатно, но сильно: уходи, пузырь, уходи! Если повезло, пузырь неохотно поднимается вверх, если нет – застывает в геле, делая значительную его часть непригодной для фореза, а студент слышит у себя за спиной: “Ничего, ручки кривые, зато старательный”… Сверху заливаем чуть менее крепкий гель, в который вставляют гребенку, чтобы получились лунки. Ждем. Гель застыл. В реакционные смеси добавляем глицерина, чтобы смесь не всплывала в растворе, а сиропчиком оседала на дно лунки, а также синего и фиолетового красителя с отрицательно заряженными молекулами, чтобы видно было, достаточно ли далеко прошел форез: раствор ДНК сам по себе прозрачен, по нему не поймешь. Вносим смесь в лунки. Аккуратненько, только не мимо лунки, а то будет каша. Не путаем, что куда, запоминаем, а лучше записываем. Готово. Ставим электрофорез. На табло источника питания четырехзначное число, обозначающее вольты, кстати, распишитесь, студенты, что поняли насчет высокого напряжения.

По прошествии изрядного времени, когда мы видим, что синее и фиолетовое пятна проехали к плюсу сколько надо, снимаем гель и сушим. Он у нас слегка радиоактивный, мы не забыли? При синтезе меченые нуклеотиды включались в цепочки ДНК, поэтому все новые молекулы фонят. Мы берем гель в темную комнату и аккуратно прижимаем его к рентгеновской пленке размером с наше стекло. Зажимаем в металлическую коробку и оставляем, скажем, до завтра. Потом проявляем пленку – и вуаля: если все сделали правильно, на прозрачной пленке темнеют полосочки, выстроенные лесенкой. Это называется “радиоавтограф геля”. Каждая полоска соответствует нуклеотиду ДНК. Кстати, сама идея метить молекулы ДНК, заставляя полимеразу включать в них нуклеотиды с радиоактивными изотопами, для удобства последующих наблюдений тоже принадлежит Фредерику Сенгеру.

Вот теперь наконец-то читаем нашу ДНК! Сначала две полоски на левой дорожке, затем одна на правой, затем на второй слева – ААGТ… Одному это расшифровывать не с руки. Зовешь помощника, даешь ему в руки линейку, велишь диктовать, а сам вбиваешь в компьютер буквы ДНК – текст, который никто еще не читал, кроме вас двоих и Господа Бога, если он вникал в такие мелочи, а не предоставил все эволюции. За один раз на четырех дорожках можно прочесть несколько сотен нуклеотидов, в идеале до тысячи. (Для сравнения, “плюс-минус” секвенирование давало около 80 нуклеотидов.) Уф-ф.

Теперь, с появлением приборов-секвенаторов, взаимодействие человека и ДНК стало менее интимным и утомительным. Человек ставит реакционную смесь в прибор и идет пить кофе… то есть писать обзор литературы для статьи. Никакой романтики преодоления трудностей. (Шучу. На самом деле трудности теперь в других местах – например, там, где начинается обработка огромного количества данных.)

Принцип метода остается тем же, что и в классическом секвенировании по Сенгеру, – синтез четырех наборов нуклеотидных цепочек, кончающихся на А, на Т, на G и на С. Только электрофорез теперь происходит не в плоском геле, а в капилляре, из которого синтезированные молекулы выходят поочередно, от самых коротких к самым длинным. И метка не радиоактивная, а флуоресцентная: каждый терминаторный нуклеотид светится своим цветом, условно говоря, А – зеленым, Т – красным, С – синим, G – желтым. (Реакционных смесей уже не четыре, а одна!) Регистрирующее устройство фиксирует вспышки на выходе из капилляра и отмечает пики свечения каждого цвета. Прибор выдает график с четырьмя кривыми, где пики соответствуют нуклеотидам; последовательность нуклеотидов сохраняется в памяти компьютера.

Первые автоматические секвенаторы начала поставлять фирма Applied Biosystems (1986). Они использовали принцип, разработанный в Калифорнийском технологическом институте, в лаборатории Лероя Худа. Что интересно, в первоначальном варианте секвенирования от Applied Biosystems реакционных смесей было четыре, и флуоресцентную метку несли не дидезоксинуклеотиды, а праймеры. Это было своего рода промежуточное звено между сенгеровским методом и последующим автоматизированным – реакция идет в четырех смесях, но все продукты бегут по одной дорожке электрофореза. Эволюция техники иногда похожа на эволюцию живых существ: полезные изменения накапливаются последовательно.

Applied Biosystems (к тому моменту подразделение компании PerkinElmer) принимала непосредственное участие в создании компании Celera Genomics, основателем которой был знаменитый Крейг Вентер, человек, который многое сделал для того, чтобы чтение ДНК вышло на новый уровень – от сотен и тысяч нуклеотидов к целым геномам. Celera Genomics вскоре прославилась как главный конкурент международного проекта “Геном человека”, а Крейг Вентер, как он сам пишет в своей автобиографии, был одним из первых клиентов Applied Biosystems еще в то время, когда руководил лабораторией в Национальных институтах здравоохранения. Важную роль в его последующих успехах, да и вообще в секвенировании генома человека сыграли автоматические секвенаторы. И наоборот: поставленная грандиозная задача – 3 млрд нуклеотидов, во времена, когда и тысячи считались успехом! – способствовала автоматизации секвенирования.

[9] Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953; 171, 737–738.

[10] Sanger F. Nobel lecture: Determination of nucleotide sequences in DNA. 1980; https://www.nobelprize.org/.

[11] Sanger F. et al. Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA // Nature. 1977; 265 (5596), 687–695; doi: 10.1038/265687a0.

[12] Sanger F. et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // PNAS USA. 1977; Vol. 74 (12), p. 5463–5467; doi: 10.1073/pnas.74.12.5463.