ДНК и её человек: читать начало книги онлайн

Эксцентричность и нонконформизм Кэри Муллиса выделяют его даже на фоне коллег и современников, среди которых мало скучных людей. В своей Нобелевской лекции[26] он отмечает, что родился в тот самый год, когда вышла “Что такое жизнь с точки зрения физика?” Эрвина Шрёдингера (1945), и добавляет: “Я жил в Колумбии, Северная Каролина, где никто не заметил, что у нас нет экземпляра [этой книги]. Но мой дом был в нескольких кварталах от дикой, неосвоенной лесной зоны с ручьем, поссумами, енотами, ядовитыми змеями, драконами и веткой железной дороги. Не нужна нам была книга”. Родители развелись, мать работала риелтором и не требовала от детей железной дисциплины. Когда Уотсон и Крик открыли структуру ДНК, братья Муллисы играли в лесу и лазили в неосвещенную ливневую канализацию под городом. Когда за открытие структуры ДНК вручали Нобелевскую премию, Кэри с товарищами увлекся ракетостроением. В качестве топлива использовали смесь калийной селитры, купленной в магазине, с сахаром, утащенным с маминой кухни, и угольной пылью. В те старые добрые времена, ностальгически вспоминает Муллис, мальчик мог спокойно купить динамитный запал. Ракета была четырех футов в длину (тут мама немного забеспокоилась). Однажды юные ракетостроители запустили лягушку пусть не в космос, но на высоту около мили, и она вернулась живой. А в другой раз напугали пилота самолета, идущего на посадку. “Виноваты”, – коротко комментирует этот случай Муллис.

В школе (еще одна вещь, сегодня почти невозможная) ученики могли бесконтрольно экспериментировать в химической лаборатории. Это занятие Кэри никогда не надоедало, и уже во время учебы в Технологическом институте штата Джорджия на каникулах Муллис с товарищем устроили лабораторию органического синтеза в старом курятнике на окраине. Синтезировали они всякие вредные и взрывающиеся вещества (в то время законодательство еще не успело запретить подобные инициативы): “Никто не хотел их делать, но кое-кто хотел их иметь, так что производство было за нами. Мы не страдали ни от скуки, ни от начальства. Мы сделали достаточно денег, чтобы приобретать новое оборудование”. Среди их клиентов был руководитель Columbia Organic Chemical Company, покупавший и перепродававший их продукцию.

Когда Кэри Муллис поступил в аспирантуру Калифорнийского университета в Беркли, уже был расшифрован генетический код, но ДНК – длинный нудный полимер – юного биохимика не интересовала, он предпочитал небольшие молекулы с интересными свойствами. Он занимался синтезом и структурой бактериального белка – транспортера железа. Ему повезло и с руководителем дипломной работы: биохимик Джон Драйан “Джой” Нейландс управлял лабораторией так, что студенты не ощущали тягот академической дисциплины. Например, Кэри Муллис выбрал в качестве спецкурса астрофизику, резонно рассудив, что молекулярной биологии он может научиться у коллег, а заниматься астрофизикой потом некогда будет. По-видимому, мечты о космосе его не отпускали. В то время он написал статью “Космологическая значимость обратного течения времени”, о “невидимом компоненте Вселенной”, для которого время движется в другую сторону. Послал ее Кэри – когда речь идет о фундаментальных проблемах, скромность неуместна! – в журнал Nature. Многие в молодости размышляют о тайнах мироздания и придумывают завиральные идеи вселенского масштаба, но случай Муллиса уникален тем, что Nature статью напечатал[27]. Публикация в журнале первого ряда выручила его, когда встал вопрос о том, может ли быть присвоена степень PhD человеку, не изучавшему молекулярную биологию.

Получив степень, Кэри Муллис отправился в Канзас, потому что его тогдашняя жена собиралась там учиться в медицинской школе. Теперь он захотел стать писателем, но быстро понял, что для этого ему не хватает жизненного опыта: герои получались плоскими и неубедительными. Пришлось вернуться к наукам о жизни (к счастью для человечества). Муллис нашел работу в медицинской школе. Через два года, после развода с женой, он возвратился в Беркли. Работал в ресторане, затем в Университете Калифорния (Сан-Франциско). А потом попал на семинар о клонировании гена соматостатина, и это так впечатлило его, что он начал искать работу, где требовалось бы синтезировать ДНК.

Такая работа нашлась в компании Cetus. С 1979 г. Муллис работал там, был очень доволен. В то время в Сан-Франциско появилось несколько биотехнологических компаний и научных групп, занимавшихся синтезом ДНК. И в начале 1980-х Муллис, уже будучи руководителем лаборатории, столкнулся с парадоксальной проблемой: у него было слишком много олигонуклеотидов – коротких кусочков ДНК с заданной последовательностью “букв”. Олигонуклеотиды, они же олиги на лабораторном жаргоне, синтезировала специальная машина, купленная в компании Biosearch, и руководитель понял, что эта механизация создает угрозу рабочим местам. Если машина синтезирует за восемь часов столько олигонуклеотидов, сколько сотрудники лаборатории вручную за три недели, зачем нужны сотрудники? Может, их уволить? Муллису эта идея не нравилась, никого увольнять он не хотел и начал размышлять над тем, куда бы применить большое количество коротких цепочек ДНК. Что бы такого сделать с помощью этого неожиданно возникшего ресурса и ловких рабочих рук, желательно с пользой и выгодой для всех?

Ночь на трассе

Итак, майской ночью 1983 г. Кэри Муллис, как обычно, ехал на своей серебристой “хонде” по трассе 128, направляясь из Беркли в Мендосино, в летний домик, где собирался провести выходные. С ним в машине была его девушка Дженнифер Барнетт, химик компании Cetus. (Роман их протекал столь бурно, что в Нобелевской лекции Муллиса о Дженнифер рассказывается едва ли не больше, чем о ПЦР.) Дорога поднималась в горы, вокруг цвели каштаны. Дженнифер спала, Кэри вел машину и думал, куда девать олиги.

В соседней лаборатории под руководством Генри Эрлиха занимались детекцией точечных мутаций в ДНК. Вот, скажем, мутации, которые гарантированно приводят к тяжелому заболеванию или смерти плода (ряд таких мутаций уже был известен). Беременная женщина по какой-то причине беспокоится, есть ли мутация у ее ребенка, если есть – это показание к аборту по страховке. Как бы это выяснить быстро, недорого и с гарантией?

Современная молекулярная диагностика все это умеет: и выделить ДНК плода из крови матери (теперь даже биопсия не нужна!), и прочитать ее определенный участок. Но в 1983 г. это казалось абсолютной утопией. Не так просто было даже получить нужный фрагмент ДНК – то есть были способы, но Кэри Муллис хотел придумать что-то побыстрее и подешевле.

Дано: мы можем синтезировать любой олигонуклеотид. Можем мы синтезировать нуклеотид, комплементарный участку рядом с мутацией, в наличии или отсутствии которой мы хотим убедиться? Нет проблем. А можем мы добавить к ДНК, которую хотим проанализировать, такой олигонуклеотид и ДНК-полимеразу, чтобы та наращивала цепочку ДНК, начиная от олигонуклеотида, совсем как в секвенировании по Сенгеру? (В такой реакции олигонуклеотид называется праймером, или затравкой, потому что с него начинается синтез ДНК.) Только пусть праймер будет вплотную к сайту (точке) мутации, а в смеси будут дидезоксинуклеотидтрифосфаты с радиоактивной меткой – те, которые у Сенгера останавливают синтез цепочки. Это будет как секвенирование одного нуклеотида. (И в самом деле, немного похоже на один цикл некоторых современных методов секвенирования!)

Теоретически мы все это можем. Практически – будут проблемы: на относительно коротком фрагменте ДНК, в несколько тысяч нуклеотидов, это сработало бы, но геном человека длинен, нужный участок короток, его концентрация исчезающе мала, к тому же есть ненулевая вероятность, что в нашем огромном геноме присутствуют другие похожие участки, с которыми может гибридизоваться олигонуклеотид. (Вспомним саузерн-блоттинги Алека Джеффриса: подобрать зонд, который не метил бы в ДНК все подряд, – непростая задача.) И как тогда отличить интересующий нас сигнал от ложного? Жизнь вечно портит самые прекрасные идеи. Ладно, пропустим это и будем думать дальше, как будто проблемы нет.

Но раз олигонуклеотидов у нас много, почему бы не сделать два олигонуклеотида, комплементарные обеим цепям ДНК, по обе стороны от сайта мутации? (Читатели не забыли, что нити ДНК имеют направление, от 5’ – к 3’ – концу, и только в этом направлении полимераза может наращивать цепь? Два таких олигонуклеотида “указывали” бы на возможную мутацию с двух сторон.) И пусть к одному олигу полимераза присоединит дидезоксинуклеотид А, а к другому – дидезоксинуклеотид Т, и мы точно убедимся, что А не заменен на G… не слишком красивая идея, зато простая и осуществимая.

Что может пойти не так? Ну, прежде всего, в образце могут быть обыкновенные свободные нуклеотиды, и ДНК-полимераза, конечно, будет присоединять их, тогда прощай радиоактивный фрагмент определенной длины. Но можно перед анализом обработать образец ферментом – бактериальной щелочной фосфатазой, которая отъест все фосфатные группы от нуклеотидов, и тогда полимеразе не с чем будет работать, кроме тех меченых нуклеотидов, которые добавим мы. Только как ее потом убрать, чтобы она добавленные нуклеотиды не съела? В то время считалось, что щелочную фосфатазу невозможно инактивировать нагреванием, якобы потом она восстанавливает активность (на самом деле инактивировать ее возможно, если не добавлять в раствор цинк, отмечал позднее Кэри Муллис, но хорошо, что я тогда об этом не знал…).

Думаем дальше: а что можно сделать, если не избавляться от обычных нуклеотидов? Пусть полимераза их использует, разрешаем. Пусть она нарастит такие длинные цепочки, какие сможет. А потом слегка нагреем раствор, чтобы двойные цепочки ДНК расплавились и разошлись, и охладим, чтобы к однонитевой ДНК присоединились новые праймеры. Олигов, как мы помним, у нас много, добавим в смесь, сколько не жалко…

Но позвольте, ведь теперь, кроме ДНК образца, у нас появились еще две нити, синтезированные в первой реакции, и каждая из них тоже содержит участок, комплементарный противоположно направленному праймеру. Четыре цепочки ДНК вместо двух изначальных… Стоп! Но это же как раз то самое, что нам было нужно: увеличение концентрации интересующего нас участка ДНК, чтобы он стал заметнее на фоне всей остальной ДНК, которая нас сейчас не интересует.

А если сделать это специально?

А если сделать это не один раз, а два, три, четыре, пять, шесть? И в каждом цикле число нитей ДНК будет удваиваться, как в той сказке про царя, изобретателя шахмат и рисовые зерна на шахматной доске…

Кэри остановил машину, нашел в бардачке ручку и бумагу и начал считать. Если, скажем, раз 30 повторить этот цикл – “добавить к образцу полимеразу, нуклеотиды и праймеры – провести реакцию – расплавить ДНК – провести реакцию” – то образец будет содержать множество копий интересующего нас фрагмента ДНК, а все остальное, ненужное и путающее, станет на его фоне малозначащей примесью.

Дженнифер проснулась и спросила, почему они не едут. Кэри снова тронулся в путь и примерно через милю сообразил, что праймеры необязательно должны быть разделены всего одним нуклеотидом. Черт с ними, с точечными мутациями – таким способом можно получить в достаточном количестве любой фрагмент ДНК!

До изобретения Кэри Муллиса эти фрагменты получали в основном клонированием. Слово “клонирование” вообще означает получение множества копий одного объекта. Клонирование животных – получение генетически идентичных копий особи из ее соматических, то есть неполовых клеток. Клонирование человека – популярный фантастический сюжет, с приматами дело пока не очень ладится (лишь в начале 2018 г., через 22 года после овцы Долли, китайцы опубликовали статью о клонировании детенышей макаки). Клонирование растений широко известно под названием “черенкование”. Клонирование клеток, например лимфоцитов, вырабатывающих антитела, – размножение клеток определенного типа.

Клонированием ДНК называли довольно сложную процедуру – включение нужного фрагмента в кольцевую ДНК (плазмиду), внедрение этой ДНК в кишечную палочку E.coli и выращивание этих кишечных палочек, сначала на чашке Петри, потом в колбе с питательной средой. Бактерии размножаются, копируют плазмиду и вместе с ней наш кусок ДНК; потом плазмиду можно будет выделить, вырезать нужный кусок рестриктазой и отделить его от других с помощью электрофореза. Дело долгое, к тому же культура кишечной палочки пахнет замоченным и протухшим бельем (точнее, наоборот, таз с бельем у нерадивой хозяйки имеет запах этой бактерии). Но ДНК нужна для работы, да и запах привычного человека радует: если так пахнет, значит, культура не загрязнена посторонними микроорганизмами.

Так вот, с самого начала было очевидно, что ПЦР намного удобнее! Клонирование in vitro, не в живой клетке, а в пробирке! Любой фрагмент ДНК в любом количестве, без всех этих танцев с бубнами вокруг кишечной палочки. И, что еще более важно, – определенный фрагмент, тот самый, который находится между нашими праймерами. Кэри снова затормозил: о такой потрясающей возможности опасно было думать на ходу.

Какой бы жуткой смесью ни была наша исходная ДНК, благодаря магии комплементарности мы получим именно нужный участок. Интересующий нас ген у конкретного человека. Ген, который мы еще не изучали, но который изучен для другого вида (мы помним, что большинство гомологичных генов млекопитающих сходны между собой)… Да это же бомба! Не какое-то там предложение по оптимизации, а открытие, которое перевернет молекулярную биологию! “«Тор всемогущий!» – вскричал я”.

…Нет, не может быть. Используя только хорошо известные методы, делая то, что все уже давно делают, разве что чуть-чуть по-другому, решить сразу несколько самых докучных проблем молекулярной биологии – это слишком просто и слишком здорово, такого не бывает. Или кто-то уже придумал это и прямо сейчас делает и вот-вот опубликуется или уже опубликовался. Или Кэри упускает что-то очевидное, и все это невозможно по какой-то фундаментальной причине, как невозможны вечный двигатель и летающая свинья.

Сонная Дженнифер не захотела выслушать его очередную гениальную идею. Сам же Муллис этой ночью не спал и все выходные проработал. Чертил бесконечные схемы своей реакции, взбадривался местным каберне, считал себя то гением, то идиотом, неспособным увидеть ошибку, которая обязана быть во всем этом, просто обязана, потому что жизнь – это боль. Интернета тогда не было, и телефона в коттедже не было, и до начала рабочей недели он не мог ни поделиться ни с кем, кроме Дженнифер (которая так и не проявила энтузиазма), ни проверить свои соображения по литературным данным.

К Нобелевской премии и далее

В понедельник поход в библиотеку показал: никто еще не пытался амплифицировать ДНК с помощью двух праймеров, и нет никаких очевидных причин, запрещающих это делать! Аналогичный результат дали беседы с коллегами. (Как это обычно бывает, много позднее дотошные люди откопали публикацию норвежского биохимика Хьелля Клеппе, работавшего у нобелевского лауреата Хара Гобинда Кораны, и их соавторов. Там были несколько фраз, очень похожих на описание принципа метода ПЦР, но они, по-видимому, так и не проверили эту идею экспериментально.)[28]

Тем не менее докладом Муллиса никто не восхитился, на лабораторном семинаре в компании Cetus его едва слушали. К счастью, идеей заинтересовался один из двух лаборантов, Фред Фалуна, и с его помощью Кэри решил попытаться амплифицировать 400-нуклеотидный фрагмент ДНК человека – участок гена фактора роста нервов. (“Амплифицировать” как раз и значит “сделать множество копий этого участка”.) Муллис оптимистично предполагал, что этот ген может состоять из одного экзона и его удастся выцепить из цельной ДНК человека, без всякой возни с клонированием и колониями, с помощью реакции, которую он только что придумал.

Единственным человеком, кроме Фалуны, который разделял энтузиазм Кэри Муллиса летом 1983 г., был Рон Кук, основатель компании Biosearch – той самой, которая вывела на рынок первую коммерчески успешную машину для синтеза ДНК. Может, потому, что это было хорошо для его бизнеса, или потому, что он был рациональным химиком с неповрежденным мозгом, саркастически замечал Муллис в своей Нобелевской лекции. Именно Кук посоветовал ему, коль скоро никто в Cetus не принимает его идею всерьез, не делиться с нанимателями результатом, который не связан напрямую с его обязанностями, а самостоятельно довести ее до ума и самому запатентовать. Но Муллис сомневался, что это возможно, и ответил, что ему нравится Cetus и что компания его, конечно же, не обидит, если идея принесет прибыль.

[26] Mullis K. B. Nobel Lecture: The Polymerase Chain Reaction. 1993. https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html.

[27] Mullis K. Cosmological Significance of Time Reversal // Nature. 18 May 1968; Vol. 218, 663–664; doi: 10.1038/218663b0.

[28] Kleppe K. et al. Studies on polynucleotides: XCVI. Repair replication of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases // Journal of Molecular Biology. 1971; Vol. 56, Issue 2, 341–361 $ doi: 10.1016/0022–2836 (71) 90469–4.