Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Ha 5’ и 3’ границах вышеупомянутого участка открытого хроматина обнаруживается резкий переход в структуре хроматина с характерными для транскрипционно репрессированных геномных участков чертами, фланкирующими островок CpG (рис. 24.6). В этих пограничных участках имеет место метилирование менее частых сайтов CpG и рекрутирование белков, связывающихся с метилцитозином (MBDs). и их партнеров (например, деацетилаз гистонов, или HDACs) к метилированным CpGs (глава 18) Участки вне островков CpG оказываются, таким образом, доступны для ферментов, которые катализируют метки метилирования гистонов, коррелирующие с сайленсингом гена. В результате действия всех этих факторов происходит деацетилирование ключевых гистоновых остатков и обнаруживаются репрессивные метки метилирования гистонов, связанные с транскрипционной репрессией, особенно H3K9me2 (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo etal., 2003).

Рис. 24.6. Модель взаимоотношений между метилированием ДНК и модификациями гистонов в районе островков CpG генного промотора в нормальных и опухолевых клетках

^{В экспрессируемом гене показана граница (сверху), молеуклярная природа которой пока не охарактеризована и которая защищает островок CpG, окружая сайт начала транскрипции (зеленая стрелка) от метилирования ДНК. Сайты. CpG в CpG-участках, фланкирующих эту защитную зону, наоборот, имеют метилированную ДНК (розовый шестиугольник, обозначенный М) и ассоциированы с такими ключевыми метками сайленсинга, как метилирование H3K9 (красный шестиугольник, обозначенный Me). Ключевые аминокислоты «хвостов» гистонов в защищенной зоне, такие как H3K9, находятся в ацетилированом состоянии (синие флажки, обозначенные Ас) и транскрипционные факторы (желтый овал, обозначенный TF) имеют доступ к участку сайта начала транскрипции. Когда в раковой клетке тот же ген аберрантно находится в состоянии сайленсинга (внизу), островок CpG характеризуется гиперметилированием ДНК, т.к. защитные границы теперь разорваны и отсутствуют. Это метилирование поддерживается комплексами ДНК-метилтрансферазы (розовые овалы, обозначены DMMT) и белковыми комплексами, связывающимися с метилцитозином, которые содержат гистон-ацетилазы (синие овалы, обозначены HDAQ), и гистон-метилтрансферазы (красные овалы, обозначены НКМТ), которые катализируют ключевые метки метилирования при сайленсинге на аминокислотных «хвостах» гистонов (таких как H3K9). TF-комплексы более не активны (отсутствие зеленой стрелки). Отображены главные подходы проводимых в настоящее время клинических испытаний по раковой эпигенетике, которые включают либо ингибиторы метилтрансфераз ДНК для блокирования гиперметилирования ДНК, либо ингибиторы HDAC для восстановления статуса ацетилирования ключевых аминокислотных остатков гистонов Как сказано в тексте, наиболее многообещающая антираковая терапия включает комбинированное использование ингибиторов DNMT1 и HDAC}

Эти соседние участки активных и репрессированных паттернов хроматина (рис. 24.6) предполагают, что промоторы активных генов, содержащие островки CpG, присущи зоне, которая «защищена», или, иными словами, не является мишенью для репрессивных меток хроматина и метилирования ДНК (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). Неотъемлемой частью этих концепций является вероятность того, что в экспрессируемых генах молекулярные «границы» существуют на 5’ и 3’ концах промоторных островков CpG. Главная проблема — это определить точную природу этих границ. В настоящее время кандидатами на эту роль могут быть: сами модификации гистонов, которые маркируют защищенный участок промотора, транскрипционные активаторные и коактиваторные комплексы, которые прямо поддерживают активную транскрипцию, комплексы белков, которые выполняют размещение нуклеосом и(или) их движение (т.е. ремоделеры нуклеосом), которые могут маркировать гены для активной транскрипции. Эти факторы могут стимулировать доступ активирующих транскрипционных комплексов, замену классических гистонов их разновидностями, такими, как H3.3 (глава 13), который, как оказалось, поддерживает активную транскрипцию, и действие инсуляторных белковых комплексов и их узнающих последовательностей. Именно с точки зрения определения того, как один или несколько этих процессов поддерживают зоны транскрипционно пермиссивного хроматина вокруг промоторов активных генов, содержащих неметилированные по ДНК островки CpG, гены, сайленсированные при раковых заболеваниях, представляют собой великолепную модель для изучения и понимания модуляций генной экспрессии в геномах млекопитающих.

Способ, которым вышеупомянутая траскрипционно активная организация хроматина промоторов, содержащих островки CpG, преобразуется в процессе развития опухоли, остается в основном неизвестным, расшифровка этого преобразования остается одной из главных проблем в области эпигенетики рака. Как было упомянуто ранее, аномально метилированные по ДНК островки CpG в промоторах генов, сопровождающиеся генным сайленсингом, часто обнаруживаются на самых ранних и предраковых стадиях развития опухоли, делая наше понимание лежащих в основе факторов потенциально очень важным для изучения биологии рака. Это также открывает новые возможности для выявления факторов риска при раке, для облегчения ранней диагностики рака и для выдвижения новых стратегий предупреждения и раннего вмешательства в канцерогенез.

Какой бы конкретный механизм, из тех, что будут рассматриваться далее в этом разделе, не был задействован. конечным результатом, проявляющимся в процессе развития опухоли, является «разлад» механизмов, которые охраняют участки островков CpG в генном промоторе от «вторжения» хроматина репрессивного типа, расположенного на 5’ и 3’ границах. Результатом является превращение конфигурации промотора из транскрипционно открытой в закрытую с более плотно упакованными нуклеосомами и потерей гиперчувствительных сайтов, а также появление множественных состояний деацетилирования и метилирования гистонов, характерных для транскрипционно репрессивного хроматина (рис. 24.6). Иерархия всех этих событий, в том смысле, которое из них является наиболее значимым в поддержке этой репрессии, все еще нуждается в определении. Однако одна важная черта, которая всплывает из анализа множественных генов, состоит в том, что какой бы ни была роль компоненты ДНК-метилирования в инициации и (или) поддержании генного сайленсинга, однажды состоявшись, она играет доминирующую роль в наследуемости транскрипционно-репрессивного состояния. Соответственно, такие терапевтические приемы как ингибирование активности HDAC специфическими лекарственными препаратами, не могут индуцировать реэкспрессию раковых генов, промоторы которых содержат в себе плотно метилированнные островки CpG Однако, если сначала применяется низкая доза такого деметилирующего агента, как 5’-деоксиазацитидин (DAC), то затем ингибиторы HDAC обнаруживают при реэкспрессии «молчащих» генов эффект аддитивности и(или) синнергизма (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002). Данная парадигма в сочетании с использованием микрочипов для поиска, реэкспрессии сайленсных базально генов доказала свою ценность даже для идентификации новых эпигенетически сайленсированных генов при раке (Suzuki et al., 2002). Аналогично этому, реэкспрессия генов, следующая за назначением DAC, может привести к устранению меток сайленсирующего метилирования гистонов из промоторных участков эпигенетически сайленсированых раковых генов (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). В этом смысле, как показано на рис. 24.6, метилирование ДНК может служить «замком», чтобы стабилизировать эпигенетический сайленсинг раковых генов и обеспечить его стабильное наследование, приводящее к потере функции генов.

Еще один ключевой вопрос из области эпигенетического сайленсинга раковых генов касается того, какая из DNMT ответственна за установление и поддержание аномального метилирования ДНК промотора, которое часто сопровождает этот процесс. Современные данные позволяют предполагать, что эти этапы могут быть опосредованы каким-то другим способом, нежели это можно было бы предположить, исходя из классической роли Dnmt, установленной при исследовании развития мышей. При развитии мышей, как вытекает из исследований нокаутов трех известных биологически активных ДНК-метилтрансфераз — Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b — два последних фермента отвечают за установление метилирования (метилирование ДНК de novo), тогда как Dnmtl ответственна за дальнейшее поддержание установленных паттернов (поддерживающее метилирование ДНК) (Li et al., 1992; более детально см. главу 18). Однако в культуре клеток рака толстой кишки исследования по генетическому разрушению DNMTs показывают, что поддержание большинства случаев общего метилирования ДНК, в том числе гиперметилирование промоторов и сопровождающий его сайленсинг генов, требует наличия как DNMT1, так и DNMT3b (Rhee et al., 2000, 2002). Изучение раковых клеток других типов дали более разнообразные результаты — от указания на некоторую степень партнерства этих двух ферментов в таком поддержании до описания генов, которые деметилируются и транскрипционно реактивируются при уменьшении количества одной только DNMT1 (Leu et al., 2003). Таким образом, вопрос о том, как DNMTs устанавливают и поддерживают аномальные паттерны метилирования ДНК в раковых клетках, требует того, чтобы исследования были продолжены. Особенно мы нуждаемся в прояснении того, посредством каких комплексов эти ферменты могли бы кооперироваться и с помощью каких механизмов они нацеливаются на промоторы генов. Несколько последних исследований показывают, что для такого рекрутирования ключевыми являются комплексы транскрипционной репрессии (Di Croce et al., 2002; Fuks et al., 2003: Brenner et al., 2005) Каковы бы ни были эти механизмы, следует помнить, что в эксперименте DNMTs млекопитающих обладают сложными функциями, включающими не только каталитическую активность, связанную с карбокситерминальными участками в отношении метилирования ДНК, но и активность, непосредственно связанную с транскрипционной репрессией в аминотерминальных доменах (см. рис. 18.3) (Robertson et al., 2000; Rountree et al., 2000; Fuks et al., 2001). Эти ферменты также могут связываться с ключевыми медиаторами транскрипционной репрессии, в том числе с HDAC и с белками, связывающимися с метилцитозином (MBDs), и потенциально рекрутировать их. Таким образом, роль DNMT в транскрипционном сайленсинге потенциально имеет много граней (от инициации до поддерживания), которые могут включать этапы метилирования ДНК, а могут и не включать их. Сайленсинг генов при раке поможет рассортировать эти возможности.

7. Резюме главных результатов исследований по осмыслению эпигенетического сайленсинга генов при раке

Приведенное выше обсуждение показывает, что мы узнали довольно много относительно молекулярных событий, которые лежат в основе появления метилированной ДНК промотора, а также генного сайленсинга в процессе развития опухоли, но едва ли не больше явлений еще требует прояснения. В табл. 24.5 суммированы как минимум некоторые наиболее важные вопросы, которые должны быть решены в будущих исследованиях. Во-первых, должны быть прояснены молекулярные события, определяющие одновременное появление общего гипометилирования ДНК и более локализованное гиперметилирование ДНК промотора. Эти перекрывающиеся состояния предполагают масштабные ошибки в нацеливании хроматина (мистаргетинг) в раковых клетках. Этиология этого явления должна послужить разъяснению того, как клетки млекопитающих укладывают свои геномы для создания соответствующих паттернов генной экспрессии и для поддержания целостности хромосом. Во-вторых, необходимо обрисовать детерминанты границ хроматина вокруг промоторов индивидуальных генов и их корреляцию как с нормальным, так и с аномальным состоянием транскрипции. Сами ли белки-инсуляторы, вовлеченные в защиту активных в норме генов от вторжения транскрипционно-репрессивного хроматина, и(или) модификации гистонов, устанавливают границы? Как могли бы эти детерминанты границ изменяться в процессе развития опухоли? В-третьих, каков порядок событий для появления аномального генного сайленсинга в раковых клетках? Требуется ли начальная даун-регуляция транскрипции гена? Предшествуют ли таргетному метилированию ДНК ключевые модификации хроматина, в том числе деацетилирование и метилирование гистоновых аминокислот и рекрутирование ферментов, которые служат связующим звеном в этом процессе (см. главу 10)? Если да, то каковы молекулярные взаимодействия, лежащие в основе такого таргетинга, и какую роль играют ключевые комплексы сайленсинга (такие как белки группы Polycomb, — см. главу 11), важные для нормальных и раковых стволовых клеток. В-четвертых, какие именно DNMT требуются для инициации и поддержания аномального метилирования ДНК промотора при раке, и как они взаимодействуют? Какой из компонентов хроматина, описанных выше, может взаимодействовать с этими ферментами и направлять их? Наконец, если аномальный генный сайленсинг уже установился при раке, какова точная иерархия молекулярных этапов, которые поддерживают его? Этот последний вопрос является не только ключевым фундаментальным вопросом, но и центральным в плане использования в медицине (что будет обсуждено далее) для реверсии аномального генного сайленсинга при профилактике и лечении рака.

8. Выявление рака посредством метилирования ДНК

Тот факт, что локальное гиперметилирование островков CpG является таким обычным в раковых клетках, в сочетании с возможностью определять метилирование с высокой степенью чувствительности, привело к развитию нескольких подходов по определению рака с использованием жидкостей организма. Приобретенные изменения в метилировании островков CpG могут быть определены на фоне, характерном для нормальных клеток, после конверсии цитозинов в урацилы, при том, что 5-метилцитозин в ДНК, обработанной бисульфитом натрия остается интактным. Очень чувствительными являются методы ПЦР, например ПЦР, специфическая к метилированию (MSP-methylation-specific PCR), при которой праймеры сконструированы так, чтобы амплифицировать только метилированные участки. Другие методы включают способы, основанные на ПЦР в реальном времени, такие как «MethyLight», где флуоресцентный зонд, который может связываться только с метилированной ДНК, используется для выявления паттернов метилирования (как показано на левом рисунка титульной страницы, где на оси Y — гены, а на оси X — типы опухолей). Эти методики могут выявлять одну метилированную аллель на фоне примерно 1,000-10,000 аллелей. Таким образом, приобретение аномального паттерна метилирования может быть легко определено; эти подходы применимы к смесям клеток или даже к разным биологическим жидкостям, таким как плазма крови, моча или мокрота (Laird, 2003). Диагностика рака посредством идентификации измененного метилирования цитозина довольно надежная из-за свойственной ДНК стабильности, в отличие от РНК и белков. Кроме того, из-за того что измененные паттерны метилирования часто канцероспецифичны, эти методы могут быть способны отличить один тип рака от другого. Сейчас имеется целый ряд исследований, как было упомянуто выше, обеспечивающих «proof of principle» для многообещающего использования гиперметилированных последовательностей ДНК промотора как исключительно чувствительной стратегии для предсказания риска раковых заболеваний или выявления их. Окончательное доказательство того, насколько ценным этот подход окажется для клиники, дожидается более широких исследований, в которых будет дана полная оценка современных гипотез. Такие исследования безусловно будут проведены в ближайшие несколько лет.

9. Эпигенетическая терапия

Наследуемая инактивация генов, имеющих отношение к раку, при помощи измененного метилирования ДНК и модификации хроматина привела к осознанию того, что сайленсированный хроматин может представлять собой жизнеспособную мишень для терапии. Таким образом, был разработан новый терапевтический поход под названием «эпигенетическая терапия», при котором лекарственные препараты, способные модифицировать хроматин или паттерны метилирования ДНК. используются либо по одному, либо в комбинации (рис. 24.7), чтобы повлиять на терапевтический результат (Egger et al., 2004).

Аналоги нуклеозидов, 5-азацитидин, 5-аза-2’-дезоксицитидин, и зебуларин, являются мощными, основанными на известных механизмах (mechanism-based) ингибиторами метилирования цитозина ДНК (рис. 24.7а). Эти препараты включаются в ДНК делящихся клеток после того, как в ходе метаболизма они превращаются в соответствующие дезоксинуклеозид-трифосфаты. Будучи включены в ДНК, они взаимодействуют со всеми тремя известными метилтрансферазами ДНК и образуют ковалентные промежуточные продукты, которые в конечном счете ингибируют метилирование ДНК в последующих раундах синтеза ДНК. Механизм действия этих веществ вполне понятен и их использовали в течение некоторого времени, чтобы реактивировать «молчащие» гены в культуре ткани или в моделях с ксенотрансплантациями (xenograft). Однако недавно они нашли применение при лечении некоторых гематологических злокачественных заболеваний, в частности, миелоидного диспластического синдрома (MDS), который является предлейкемическим состоянием, возникающим, в основном, у пожилых пациентов (Lubbert, 2000; Wijermans et al., 2000; Silverman et al., 2002; Issa et al., 2004). Клинические реакции для пациентов с таким нарушением и с лейкемиями, которые могут развиться из предлейкемического состояния, становятся все более драматичными. Соответственно, лекарства на основе 5-азацитидина и 5-аза-2’-деоксицитидина (их клинические названия — Видаза (Vidaza) и Децитабин (Decitabine), соответственно) сейчас одобрены American Food and Drug Administration (FDA) для лечения пациентов с данными нарушениями. Зебуларин (Zebu-larine), который также является основанным на известных механизмах (mechanism-based) ингибитором ДНК-метилтрансфераз, находится на более ранней стадии клинической разработки. К настоящему моменту не обнаружены эффективные ингибиторы, не требующие включения в ДНК, но для клинических целей они могли бы быть более желательны, так как могли бы давать меньше побочных эффектов. Сейчас предпринимаются многочисленные попытки синтезировать и (или) обнаружить такие препараты.

Хотя было показано, что Видаза и Децитабин клинически эффективны, оказалось труднее четко установить, что мишенями действия этих лекарств являются промоторы метилированных генов. Предварительные эксперименты позволили предположить, что ген-супрессор опухоли,/? 15у становится деметилированным после лечения Децитабином (Daskalakis et al., 2002); однако, остается показать, действуют ли эти препараты, индуцируя экспрессию гена, или по какому-нибудь другому механизму.

Клинические испытания проходят также с использованием HDACs (рис. 24.76). Известно несколько препаратов, способных вызывать существенное ингибирование HDACs. Некоторые из них, такие как фенилбутановая кислота или вальпроевая кислота, в течение некоторого времени использовались для лечения других заболеваний (Marks et al., 2001; Richon and O’Brien, 2002). Эти препараты ингибируют все деацетилазы, и неясно, связана ли их эффективность в лечении определенных форм злокачественных заболеваний именно с ингибированием деацетилирования гистонов, а не с какой-либо другой реакцией. Более новые соединения, такие как субероиланилидгидроксамовая кислота (SAHA) и депсипептид, являются более специфичными ингибиторами гистоновых деацетилаз и показывают хорошие клинические результаты (рис. 24.8). Однако, опять же, трудно быть уверенным в том, что эти лекарства действуют на пациентов только в соответствии с теоретическими механизмами.

^{Рис. 24/7. Структуры аналогов нуклеозидов — ингибиторов метилирования ДНК (а) и ингибиторов деацетилирования гистонов (б)}

^{(а) Известно три нуклеозидных аналога, которые могут ингибировать метилирование ДНК после включения в ДНК 5-аза-цитидин (Видаза) и 5-аза-2’-дезоксицитидин (Децитабин) одобрены для лечения лейкемии. Зебуларин находится на более ранней стадии разработки; (б) несколько примеров многих ингибиторов гистоновых деапетилаз, некоторые из них в настоящее время находятся на стадии клинических испытаний}

Новейшие клинические испытания, основанные на взаимодействии хроматина с метилированием ДНК, обсуждавшемся в предыдущих разделах (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002), сфокусированы на комбинировании ингибиторов метилирования ДНК и ингибиторов HDACs, в попытке использовать более низкие дозы препаратов обоих классов, но получить при этом сильный синергистический эффект. Несколько интригующих клинических испытаний проводятся в настоящее время для проверки данных гипотез, однако все еще не ясно, будут ли работать эти подходы.

Рис. 24.8. Ингибиторы деаиетилаз гистонов могут вызывать регрессию опухоли

^{Компьютерные томограммы (СТ) пациента с мезотелиомой (левый снимок) Перед лечением в правом легком наблюдалась большая плоская белая масса, сжимавшая аэрируемую черную часть легкого (см. стрелку). (Правый снимок) Спустя 4 месяца после лечения препаратом SAHA; наблюдается сморщивание опухоли и гораздо более расправленное правое легкое (снимки любезно предоставлены Др. Полом Марксом — Paul Marks, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY.)}

Хотя метод эпигенетической терапии имеет хорошую теоретическую базу отсутствие специфичности в действии некоторых агентов дает повод для беспокойства. Например, аналоги нуклеозидов являются неспецифическими ингибиторами ДНК-метилтрансфераз и ингибируют метилирование ДНК во всем геноме. Поэтому существует возможность непреднамеренной реактивации генов в результате такой терапии, хотя это не представляется проблемой для тех пациентов с серьезными заболеваниями, которые уже были пролечены. Точно так же, есть несколько дополнительных модификаций хроматина помимо деацетилирования, такие как метилирование ключевых аминокислот гистонов, о которых говорилось в предыдущих главах, которые потенциально могут быть мишенями для терапии. Существует, следовательно, значительная заинтересованность в поиске новых мишеней для терапии с целью активировать «молчащие» гены, и в ближайшие годы ожидаются волнующие результаты на этом поприще.

Литература

 Amann J.M., Nip J., Strom D.K., Lutterbach B., Harada H., Lenny N., Downing J.R., Meyers S., and Hiebert S.W., 2001. ETO, a target of t(8;21) in acute leukemia, makes distinct contacts with multiple histone deacetylases and binds mSin3A through its oligomerization domain. Mol. Cell. Biol. 21: 6470-6483.

Baylin S.B., Fearon E.R., Vogelstein B., de Bustros A., Sharkis S.J., Burke P.J., Staal S.P., and Nelkin B.D., 1987. Hypermethylation of the 5' region of the calcitonin gene is a property of human lymphoid and acute myeloid malignancies. Blood 70: 412-417.

Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A., Michels R., Saccomanno G., Gabrielson E., Baylin S.B., and Herman J.G., 1998. Aberrant methylation of pl6INK4a is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 11891-11896.

Brenner C., Deplus R., Didelot C., Loriot A., Vire E., De Smet C., Gutierrez A., Danovi D., Bernard D., Boon Т., et al., 2005. Мус represses transcription through recruitment of DNA methyltransferase compressor. EMBO J. 24. 336-346.