Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

^{Рис. 3.11. Координированная модификация хроматина}

^{Переход не подвергавшейся воздействию хроматиновой матрицы в активный эухроматин (слева) или образование репрессивного гетерохроматина (справа), включающие ряд скоординированных модификаций хроматина. В случае активации транскрипции это сопровождается действием комплексов ремоделинга нуклеосом и замещением коровых гистонов гистоновыми вариантами (желтый цвет, а именно H3.3)}

8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина, и варианты гистонов

Другим важным механизмом, посредством которого индуцируются переходы в хроматиновой матрице, является выработка сигналов [signaling] для рекрутирования комплексов «ремоделинга» хроматина, использующих энергию (гидролиз АТФ) для изменения хроматина и состава нуклеосом нековалентным образом. Нуклеосомы, особенно когда они связаны репрессивными факторами, ассоциированными с хроматином, нередко «навязывают» транскрипционной машине состояние значительного подавления. Отсюда лишь некоторые транскрипционные факторы и регуляторы, специфичные к определенным последовательностям (хотя и не базовая транскрипционная машина), способны получать доступ к сайту (сайтам) своего связывания. Эта проблема доступа решается, хотя бы отчасти, белковыми комплексами, которые мобилизуют нуклеосомы и (или) изменяют нуклеосомную структуру. Ремоделинг хроматина часто функционирует совместно с ферментами, активирующими модификации хроматина, и связанные с ним активности в целом можно разделить на два семейства: семейство SNF2H, или ISWI, и семейство Brahma, или SWI/SNF. Семейство SNF2H/ ISWI мобилизует нуклеосомы вдоль ДНК (Tsukiyama et al., 1995: Varga-Weisz et al., 1997), тогда как Brahma/SWI/ SNF на время изменяет структуру нуклеосомы, экспонируя контакты ДНК: гистон с использованием механизмов, которые только сейчас начинают раскрываться (глава 12).

Кроме того, некоторые из гидролизующих АТФ активностей схожи с «обменными комплексами», которые сами предназначены для замещения обычных коровых гистонов специализированными «вариантными» гистоновыми белками. Эта осуществляемая с затратами АТФ перетасовка в действительности может быть средством замещения существующих модифицированных гистоновых «хвостов» новым, свободным от старого, набором вариантных гистонов (Schwartz and Ahmad, 2005). Альтернативная возможность заключается в том, что рекрутирование таких комплексов ремоделинга хроматина, как SAGA (Spt-Ada-Gcn5-aцeтилтpaнcфepaзa), может быть также усилено пред существующими модификациями гистонов, чтобы обеспечить транскрипционную компетентность промоторов-мишеней (Grant et al., 1997; Hassan et al., 2002).

В дополнение к инициации транскрипции и установлению первичного контакта с промоторным районом прохождению РНК-полимеразы II (или РНК-полимеразы 1) во время происходящей в ходе транскрипции элонгации препятствует, сверх того, присутствие нуклеосом Поэтому требуются механизмы для обеспечения завершения образующихся транскриптов (особенно с длинных генов). В частности, ряд гистоновых модификаций и докинг-эффекторов действуют совместно с такими комплексами ремоделинга хроматина, как SAGA и FACT (для облегчения транскрипции хроматина) (Orphanides et al., 1998), обеспечивая прохождение РНК-полимеразы II через нуклеосомные порядки. Эта совместная активность обычно индуцирует, например, увеличенную мобильность нуклеосом, смещает димеры Н2А/Н2В и стимулирует обмен коровых гистонов на гистоновые варианты. Как таковая, она дает прекрасный пример тесного взаимодействия между модификациями гистонов, ремоделингом хроматина и обменом на гистоновые варианты для облегчения инициации транскрипции и последующей элонгации (Sims et al., 2004). Были охарактеризованы и другие комплексы ремоделинга, такие как Mi-2 (Zhang et al., 1998; Wade et al., 1999) и INO-80 (Shen et al., 2000), участвующие в стабилизации репрессированного, а не активного хроматина.

Композиционные различия хроматиновой фибриллы, которые возникают благодаря присутствию гистоновых вариантов, вносят вклад в индексирование участков хромосом для специальных функций Каждый гистоновый вариант представляет собой замену для конкретного корового гистона (рис. 3.12), хотя гистоновые варианты часто составляют малую долю от всей массы гистонов, в силу чего их труднее исследовать, чем регулярные гистоны. Возрастающий объем литературы (обзор см.: Henikoff and Ahmad, 2005; Sarma and Reinberg, 2005) свидетельствует, что гистоновые варианты обладают своей собственной характеристикой восприимчивости к модификациям, вероятно определяемой небольшим числом аминокислотных замен, отличающих их от членов их семейства. С другой стороны, некоторые варианты гистонов имеют отличающиеся амино- и карбокситерминальные домены с уникальной, в отношении регуляции хроматина, активностью и различным сродством к связывающимся факторам. В качестве примера можно привести транскрипционно активные гены, у которых гистон H3 заменен вариантом H3.3, в связанном с транскрипцией механизме, который не требует репликации ДНК (Ahmad and Henikoff, 2002). Замещение корового гистона Н2А вариантом H2A.Z коррелирует с транскрипционной активностью и может индексировать 5 — конец свободных от нуклеосом промоторов. Однако H2A.Z был ассоциирован также и с репрессированным хроматином. CENP-A, специфичный для центромеры вариант гистона H3, существен для центромерной функции и, отсюда, для сегрегации хромосом. Н2А.Х, вместе с другими гистоновыми метками, ассоциируется с выявлением повреждений ДНК и, по-видимому, индексирует повреждение в ДНК для рекрутирования комплексов репарации повреждений ДНК. МакроН2А — вариант гистона, специфически ассоциирующийся с неактивной Х-хромосомой (Xi) у млекопитающих (дальнейшие детали по вариантам гистонов см. в главе 13).

Рис. 3.12. Варианты гистонов

^{Доменная структура белка для коровых гистонов (H3, Н4, Н2А, Н2В), линкерного гистона Н1 и вариантов гистонов H3 и Н2А. Показаны свернутый домен гистона (HFD — histone fold domain), где происходит димеризация гистона, и участки белка, отличающиеся у гистоновых вариантов (показаны красным цветом)}

Важно отметить (и это противоречит обычно встречающемуся в учебниках утверждению, что гистоны синтезируются и занимают свое место только во время S-фазы), что синтез и замещение многих из этих гистоновых вариантов происходят независимо от репликации ДНК. Следовательно, замещение коровых гистонов гистоновыми вариантами не ограничено стадиями клеточного цикла (т. е. S-фазой), но может немедленно вступать в силу в ответ на действующие в данный момент механизмы (например, транскрипционную активность или напряжение кинетохора во время клеточного деления) или стрессовые сигналы (например, повреждение ДНК или голодание). Элегантные биохимические исследования позволили документировать ремоделинг хроматина или обменные комплексы, специфичные для замещения отдельных гистоновых вариантов, таких как H3.3, H2A.Z или Н2А.Х (Cairns, 2005; Henikoff and Ahmad, 2005; Sarnia and Reinberg, 2005). Например, замещение H3 вариантом H3.3 опосредуется действием обменного комплекса HIRA (регулятор гистона A) (Tagani et al., 2004), а Н2А замещается H2A.Z благодаря активности обменного комплекса SWR1 (связанная с Swi2/ Snf2 АТФаза I) (Mizuguchi et al., 2004). В совокупности эти замещения позволяют вариантным нуклеосомам строить особенно активный хроматин. Для некоторых других гистоновых вариантов механизм «нацеливания» и обмена еще остается определить; они осуществляются либо через зависимый от АТФ комплекс обмена гистонов, либо через шаперонный белок гистонов Сейчас даже постулировали, что обменные комплексы могут существовать для замещения модифицированных гистонов их модифицированными партнерами как механизм для стирания более прочных эпигенетических меток, размещенных в аминоконцах гистонов.

Метилирование ДНК — эпигенетический механизм, о котором раньше других стало известно, что он коррелирует с репрессией генов (Razin and Riggs, 1980). В той

9. Метилирование ДНК

или иной степени оно имеет место у всех эукариот за исключением дрожжей. Эта модификация заключается в добавлении метальной группы к цитозиновым остаткам матрицы ДНК. У млекопитающих она происходит по динуклеотидам, тогда как у N. crassa и растений известны другие паттерны метилирования, симметричные, асимметричные и не по CpG. Распределение метилированной ДНК по геному показывает ее повышенное содержание в некодирующих районах (например, центромерном гетерохроматине) и в рассеянных (interspersed) повторяющихся элементах (транспозонах), но не в островках CpG активных генов (Bird, 1986). Действительно, повышенные уровни метилирования ДНК коррелируют с относительным увеличением содержания некодирующей и повторяющейся ДНК в геномах высших эукариот (рис. 3.15 в разделе 11). Экспериментальные данные показывают, что это происходит потому, что метилирование ДНК служит главным образом как защитный механизм, чтобы подавлять значительную часть генома чужеродного происхождения (т. е. реплицированные перемещающиеся элементы, вирусные последовательности и другие повторяющиеся последовательности).

ДНК-метилтрансферазы (DNMTs) являются «эффекторами» метилирования ДНК и катализируют либо метилирование de novo (т. е. в новых сайтах), либо поддерживающее метилирование полуметилированной ДНК после репликации ДНК (глава 18). Утрата способности поддерживать метилирование ДНК может приводить к некоторым заболеваниям, таким как ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial abnormalities — иммунодефицит, центромерная нестабильность и лицевые аномалии) (главы 18 и 23) Дерегуляция в уровнях метилирования ДНК вносит вклад и в прогрессию рака (глава 24).

Что представляют собой сигналы, направляющие DNMTs для метилирования определенных участков ДНК? В настоящее время известно, что для того, чтобы «направить» метилирование ДНК de novo, высокоповторяющиеся тандемные последовательности в геноме (например, перицентромерный хроматин) «опираются» на репрессивные метки метилирования по H3К9, как это показано у N. crassa и растений (главы 6 и 9). Рассеянные (interspersed) повторы также могут сигнализировать о метилировании ДНК de novo, как это описано в контексте RIP у N. crassa (Tamaru and Selker, 2001) и сайленсинга ретротранспозонов в зародышевом пути у самцов млекопитающих. Отвечающий за это белок идентифицирован (Dnmt3L) и мог бы функционировать путем сканирования генома для отыскания высоких уровней границ «гомология — гетерология», служащих сигналом о необходимости метилирования ДНК (Bourc’his and Bestor, 2004). У растений сигнал для метилирования ДНК de novo обеспечивают РНК посредством уникального механизма, названного РНК-зависимым метилированием ДНК (RdDM; глава 9). Имеются данные о том, что для глобальных паттернов метилирования ДНК почему-то необходимы комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина и относящиеся к семейству SWI/SNF, как это показано на растениях (Jeddeloh et al., 1999) для белка DDM1 и на млекопитающих с помощью гомолога Lshl (Yan et al. 2003). Наконец, белок EZH2 (относящийся к HKMT-PcG) тоже может участвовать в «направлении» метилирования ДНК в некоторых промоторах у млекопитающих (Vire et al., 2005).

Способ, посредством которого установившееся метилирование ДНК может обусловливать сайленсинг хроматина, выяснен еще не полностью, хотя данные указывают на trans-регуляцию. Белки, связывающиеся с метилированными цитозинами и названные доменными белками, связывающимися с метил-CpG (MBD), могут рассматриваться как основанный на метилировании ДНК эквивалент элементов связывания [binders] (или «считывателей») модифицированных гистоновых мотивов (рис. 3.13). Например, белок, связывающийся с метил цитозином (МеСР2), связывается с метилированными CpG и рекрутирует HDACs, служа связующим звеном для репрессивных гистоновых меток (глава 18) Известно также, что метилирование ДНК нарушает сайты распознавания регуляторов транскрипции (например, СЕСА), участвующих в геномном импринтинге (глава 19).

Наличие метилированной ДНК в импринтированных локусах, обусловливающей сайленсинг либо материнской, либо отцовской аллели у растений и плацентарных млекопитающих, позволяет предположить, что в ходе эволюции эти организмы уникальным образом приспособили этот эпигенетический механизм для стабилизации репрессии генов. Интересно отметить, что у сумчатых метилирования ДНК в импринтированных локусах нет, что указывает на то, что вовлечение этого механизма в импринтинг у млекопитающих является относительно недавним эволюционным событием (главы 17 и 19). Напротив, у таких двукрылых насекомых, как Drosophila, метилирование ДНК как функциональный эпигенетический механизм в основном утрачено (Lyko, 2001).

Высокоповторяющиеся участки генома млекопитающих, обычно метилированные, становятся все более мутагенными, когда они не метилированы, — до такой степени, что вызывают глобальную геномную нестабильность (Chen et al., 1998). В результате возникают хромосомные аномалии, являющиеся главной причиной многих болезней и прогрессии рака (см. раздел 15). Это подчеркивает решающую роль метилирования ДНК в обеспечении целостности генома. С другой стороны, отдельные метилированные остатки цитозинов весьма предрасположены к спонтанному мутированию. Таким образом, со временем в результате реакции дезаминирования возникают транзиции С-Т (рис. 3.13), но полагают, что эта характеристика благоприятна для защиты хозяйского генома, потому что она постоянно дезактивирует такие паразитические нуклеотидные последовательности ДНК, как транспозоны. В ином контексте эта же самая химическая реакция активно катализируется дезаминазой, индуцируемой активацией, или AID (activation-induced deaminase). Экспрессия этого энзима в В- и Т-клетках вызывает «соматические гипермутации» в иммуноглобулиновом локусе (lg). Это важный механизм расширения репертуара рецепторов антигенов и, отсюда, усиления иммунитета у млекопитающих (Petersen-Mahrt, 2005; Глава 21). Экспрессия AID, наблюдаемая в раннем развитии млекопитающих, привела к предположению, что она может обеспечивать альтернативный путь к деметилированию ДНК, хотя это происходило бы на фоне риска повышенной частоты точечных мутаций.

Рис. 3.13. Метилирование и дезаминирование ДНК

^{Метилированные (Ме) цитозиновые нуклеотиды могут быть связаны с метилДНК-связывающимися белками (MBD) Несвязанный 5-метилцитозин склонен спонтанно мутировать в результате дезаминирования (реакция, изображенная в нижней части рисунка); в результате в нуклеотидной последовательности ДНК происходит траH3иция 5-метил-СрС в ТрА}

Метилирование ДНК и метилирование гистонов являются известными механизмами эпигенетической регуляции генома Некодирующие РНК, как описано в следующем разделе, являются важными первичными триггерами для индукции «молчащего» хроматина. Известно также, что молекулы РНК могут быть интенсивно метилированы по сахарному или нуклеозидному скелету. Более того, показано, что метилирование малых некодирующих РНК на З’-конце стабилизирует эти молекулы (Yu et al., 2005). Любопытно, что Dnmt2 недавно была идентифицирована как метилтрансфераза тРНК (Goll et al., 2006). Поэтому похоже, что РНК-метилтрансферазы, подобные DNMTs и HKMTs, могут существовать как «считыватели» эпигенетической информации, хотя прямых данных, подтверждающих это, нет. Однако метилирование РНК, по-видимому, «чувствуется» определенными Toll-подобными рецепторами (трансмембранными рецепторами, которые распознают молекулярные мотивы обычных патогенов), чтобы опосредовать врожденный иммунитет (Ishii and Akira, 2005), что говорит в пользу такой гипотезы. Возникает интересная возможность, что метилирование РНК может все же быть эпигенетической модуляцией на основе третьей формы метилирования.

10. РНКи и сайленсинг генов, направляемый РНК

Сведения о том, что конститутивный гетерохроматин в центромерах и теломерах играет инструктивную роль в обеспечении целостности генома, способствовали сдвигу парадигмы во взглядах на повторяющуюся некодирующую «мусорную» ДНК. Возможно ли, что эти повторяющиеся последовательности служат каким-то «незряшным» целям, которые еще только начинают проясняться? Не может ли даже быть так, что эти нуклеотидные последовательности ДНК не являются полностью «молчащими»?

Такая возможность вытекает из фундаментальной серии открытий, связывающих РНКи с образованием «молчащего» хроматина (гетерохроматина). РНКи является защитным механизмом организма-хозяина, который разбивает dsRNA на мелкие молекулы РНК (известные как короткие интерферирующие РНК или siRNA). Этот процесс в конечном счете приводит к деградации РНК или к использованию этих малых РНК для подавления трансляции, известного как посттранскрипционный сайленсинг (PTGS). Открытый позже механизм транскрипционного сайленсинга генов (TGS), ведущего к образованию гетерохроматина, был обнаружен в результате конвергенции независимых линий исследования хроматина и механизма РНК-интерференции. С одной стороны, многое известно о репрессивном метилировании ДНК (у грибов, растений и млекопитающих), модификациях хроматина (например, H3К9me3) и ассоциированных с хроматином факторах (НР1), характерных для доменов гетерохроматина. С другой стороны, исследователи преуспели в идентификации факторов механизма РНКи (например, Dicer, Argonaute, РНК-зависимой РНК-полимеразы, или RdRP). Наиболее убедительный прогресс, связавший вместе эти вроде бы разные области, был достигнут в элегантных исследованиях на S. pombe, в которых мутации любого компонента механизма РНКи приводили к дефектам в расхождении хромосом (Hall et al., 2002; Reinhart and Bartel, 2002; Volpe et al., 2002). Это было вызвано неспособностью стабилизировать центромерный гетерохроматин и подчеркивало, по-видимому, широко распространенную роль механизмов, опосредованных РНКи, в образовании доменов «молчащего» гетерохроматина. Это также высветило значение гетерохроматина помимо транскрипционного сайленсинга генов — его роль в поддержании целостности генома и, отсюда, жизнеспособности, как показывает необходимость центромерного гетерохроматина для процесса расхождения хромосом. Появляющиеся данные позволяют также предполагать, что siRNAs требуются для определения других специализированных районов функционального гетерохроматина, таких как теломеры.

Транскрипция с обеих нитей ДНК прицентромерных районов у S. pombe и выявление прошедших процессинг дериватов siRNAs явились сильным доказательством того, что дериват dsRNA был важнейшим субстратом для «нацеливания» комплекса RITS на центромеры для сайленсинга (рис. 3.14) (Verdel et al., 2004). Более того, мутанты clr4 (имеющийся у S. pombe ортолог Suv39h HKMT млекопитающих) были не способны процессировать dsRNA до siRNAs, усиливая тем самым доводы в пользу взаимосвязи между механизмом РНКи и сборкой гетерохроматина (Motamedi et al., 2004). Каким именно образом siRNAs, генерируемые механизмом RNAi (т. е. Dicer, Argonaute, RdRP), инициируют сборку гетерохроматина или направляют ее на соответствующие локусы в геноме, все еще неизвестно Была предложена модель, в которой сложное взаимодействие между входящим в состав механизма RNAi комплексом RITS и центромерными повторами ведет к самоусиливающемуся циклу формирования гетерохроматина, включающему Clr4, HDACs, Swi6 (ортолог НР1 млекопитающих) и когезин, вероятно через направляемый Ago отжиг гибридов РНК: РНК до образующегося транскрипта (рис. 3.14) (главы 6 и 8).

У Tetrahymena аналогичный механизм «нацеливания», опосредованного РНК, направляет уникальный процесс элиминации ДНК в соматическом ядре. В этом случае на соответствующей стадии полового процесса происходит, с обеих нитей, транскрипция внутреннего элиминируемого сегмента (IES — internal eliminated segment) в «молчащем» геноме зародышевого пути (микронуклеарном геноме) (Chalker and Yao, 2001; Mochizuki et al., 2002). Аналогично модели TGS, зависимого от RNAi, была предложена модель сканирующей РНК (scnRNA) для объяснения того, как нуклеотидные последовательности ДНК в родительском макронуклеусе могут эпигенетически контролировать геномные изменения в новом макронуклеусе с участием малых РНК (детали см. в главе 7). Эти волнующие результаты впервые демонстрируют RNAi-подобный процесс, непосредственно изменяющий соматический геном. Возникает любопытная возможность, что межгенные РНК, продуцируемые в локусе V-DJ (Bolland et al., 2004), потенциально могут направлять элиминацию нуклеотидной последовательности ДНК в ходе V-DJ-рекомбинации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) в В-клетках и локусов Т-клеточного рецептора (TCR) в Т-клетках.