Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Далее перечислены основные признаки контаминации и методы их выявления.

1. Визуальная оценка. Одним из первых признаков контаминации является изменение прозрачности культуральной среды. Бактериальная и грибковая контаминация может вызывать помутнение. В средах часто присутствуют индикаторные красители, например феноловый красный, изменяющие свой цвет в зависимости от pH среды. Значимое закисление среды может быть обусловлено контаминацией культуры. Визуальные признаки контаминации при световой микроскопии включают появление маленьких движущихся точек (бактерии) или нитей (грибы). Особый тип контаминации связан с заражением культуры микоплазмой. Микоплазмы слишком малы, чтобы их можно было увидеть под обычным световым микроскопом, но их можно обнаружить с помощью специальной флуоресцентной окраски.

2. Окрашивание. Флуоресцентные красители DAPI или Hoechst связываются с ДНК и позволяют визуализировать ядра клеток (чаще используется Hoechst, так как он может проникать в живые клетки и не требует фиксации/пермеабилизации клеток проверяемой линии, в отличие от DAPI). При наличии микоплазмы будет наблюдаться большое количество маленьких точек вне ядер клеток. Окрашивание по Граму помогает выявить бактериальную контаминацию и различить грамположительные и грамотрицательные бактерии. Использование антител, специфичных к определенным источникам контаминации, способствует их выявлению с помощью флуоресцентной микроскопии.

3. Молекулярные методы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из самых надежных методов для обнаружения микоплазмы. ПЦР позволяет амплифицировать специфические последовательности ДНК микоплазмы. Однако различные виды и штаммы микоплазмы могут отличаться по последовательности ДНК, в связи с чем некоторые наборы для ПЦР на микоплазму могут выявлять не все случаи контаминации. Одним из вариантов выявления источника контаминации является секвенирование нуклеиновых кислот.

4. Культуральные методы. Посев культуры на селективные или индикаторные среды (см. раздел III о культивировании микроорганизмов) может помочь выявить и идентифицировать конкретные микроорганизмы, вызвавшие контаминацию.

Техники культивирования клеток

Для работы как с первичными культурами клеток, так и с клеточными линиями могут использоваться различные техники культивирования.

Классические двухмерные культуры адгезионных клеток

Классические двухмерные техники культивирования клеток – основной метод работы с адгезионными клеточными культурами, который используется в биологических и медицинских исследованиях, фармацевтике, биотехнологии и других областях. Этот метод основан на культивировании клеток слоем на поверхности культуральной посуды и обеспечивает простоту наблюдения при помощи микроскопа. Иногда используются мультипланарные камеры, в которых размещается несколько уровней культуральных поверхностей, что позволяет увеличить число клеток и производительность эксперимента, но усложняет наблюдение за клетками и их визуализацию.

Классические двухмерные техники отличаются простотой и доступностью, не требуют сложного оборудования и специальных навыков, поэтому их легко использовать в лабораторной работе. Они обеспечивают точный контроль условий культивирования клеток, таких как температура, влажность, концентрация CO₂ и уровень питательных веществ, а также возможность непосредственной визуализации клеток, их компонентов и клеточных процессов, что позволяет исследователям наблюдать динамику клеточных процессов в реальном времени. Клеточные культуры, выращиваемые с использованием классических двухмерных техник, могут быть адаптированы для проведения экспериментов в различных масштабах, от маленьких культуральных флаконов и чашек Петри до больших биореакторов.

Классические двухмерные техники культивирования клеток широко используются в исследовательских и прикладных целях, включая такие исследования клеточной биологии, как анализ клеточных структур и функций, выявление и изучение патологических процессов и болезней, оценка токсичности и эффективности лекарственных препаратов, производство биологически активных веществ и биотехнологических продуктов.

Суспензионное культивирование

Суспензионное культивирование клеток – метод, при использовании которого клетки выращиваются в суспензии в питательной среде, а не прикрепляются к поверхности культуральной посуды. Этот метод чаще используется при работе с клетками, которые для роста не нуждаются в прикреплении. Большинство адгезионных культур при откреплении от поверхности испытывают аноикис, частный вариант апоптоза, однако некоторые адгезионные культуры могут быть переведены в суспензионную путем постепенной адаптации к суспензионным условиям или трансформации, при этом используются антиадгезивные покрытия и добавки к среде – полигидроксиэтилметакрилат (polyHEMA) или поливиниловый спирт (PVA). Также могут применяться ингибиторы Rho-киназы (ROCK-ингибиторы, например, Y-27632), которые предотвращают апоптоз и улучшают выживание клеток в условиях стресса.

Суспензионное культивирование имеет ряд преимуществ и недостатков по сравнению с адгезионным. Оно позволяет достичь более высокой плотности клеток: так как клетки распределены в объеме среды, этот процесс можно легко масштабировать, увеличивая объем культуральной среды и размеры биореакторов. Клетки в суспензии находятся в относительно однородных условиях по питательным веществам и газообмену, особенно при перемешивании среды. При суспензионном культивировании легче автоматизировать процесс и контролировать параметры культивирования, такие как pH, температура и концентрация растворенного кислорода. Однако не все типы клеток могут быть выращены в суспензии. Множество клеточных линий для роста и дифференциации требуют прикрепления. Чтобы обойти этот фактор, иногда используются специальные носители, например шарики из различных материалов – декстрана, желатина или синтетических полимеров, которые создают поверхность для прикрепления клеток в суспензионной культуре. Непосредственная визуализация клеток и клеточных процессов в суспензионной культуре затруднена, что усложняет мониторинг клеточного состояния в реальном времени. В некоторых случаях клетки могут образовывать кластеры или агрегаты, это препятствует равномерному распределению клеток и питательных веществ. Для масштабирования требуются специальные биореакторы и системы перемешивания, что увеличивает стоимость оборудования и обслуживания.

Культивирование клеток на вставках типа Transwell

Культуральные вставки типа Transwell, также известные как клеточные вставки, представляют собой специальные многокамерные устройства, используемые для культивирования клеток в двухмерных и трехмерных условиях. Клеточные вставки широко используются в биологических и медицинских исследованиях для создания моделей тканей и органов in vitro, а также для изучения клеточной миграции, инвазии, дифференциации и взаимодействия клеток.

Особенности культуральных вставок типа Transwell

1. Многокамерная конструкция. Клеточные вставки состоят из верхней и нижней камер, разделенных мембраной. Верхняя камера обычно имеет форму цилиндра с дном, образованным мембраной, а нижняя – цилиндрическая или прямоугольная, одна для каждой верхней камеры или общая для нескольких. Эта конструкция позволяет располагать клетки на верхней и/или нижней поверхности мембраны, обеспечивая доступ к питательным веществам и газам, проходящим через мембрану, а также взаимодействие клеток, размещенных в верхней и нижней камерах при разделении мембраной.

2. Мембрана с порами. Мембрана культуральных вставок обычно имеет пористую структуру с определенным размером пор (например, 0,4, 1, 3 или 8 мкм), что позволяет питательным веществам, газам и молекулам диффундировать через нее. Размер пор мембраны выбирается в зависимости от конкретных требований эксперимента, что делает эти вставки универсальным инструментом для различного применения. Большие поры обеспечивают миграцию клеток, а меньшие предотвращают ее.

3. Возможность создания градиентов. Культуральные вставки типа Transwell позволяют создавать градиенты различных молекул и сигналов между верхней и нижней камерами. Это может быть использовано для изучения миграции, инвазии, дифференциации и других клеточных процессов, которые зависят от градиентов молекул.

4. Возможность оценки состояния клеток по физическим характеристикам. Для клеток, выращенных на вставках типа Transwell, можно оценивать определенные электрические характеристики. С помощью омметра и системы электродов, опускаемых в верхнюю и нижнюю камеры, оценивается так называемое трансэпителиальное (или трансэндотелиальное) электрическое сопротивление (TEER, от англ. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance), которое коррелирует с числом клеток и плотностью межклеточных контактов. При импедансной спектроскопии можно получить данные не только о TEER, но и о фоновом сопротивлении и электрической емкости, т. е. дополнительную информацию, например, об изменении площади клеточных мембран при формировании микроворсинок на клетках. Оценка параметров в динамике позволяет контролировать рост и дифференциацию клеток, оценивать влияние различных факторов и сохранение или исчезновение состоятельного клеточного барьера.

Культуральные вставки типа Transwell используются при изучении клеточной миграции и инвазии, моделировании барьерных функций тканей (например, эпителиальных и эндотелиальных барьеров в легких, кишечнике, сосудах, плаценте, гемато-энцефалического барьера и др.), изучении взаимодействия клеток и сигнальных путей, оценке проницаемости и транспортных функций клеток, проведении дифференциации клеток в трехмерных условиях и т. п.

Трехмерные культуры клеток

Трехмерные (3D) культуры представляют собой модели тканей и органов, созданные из трехмерных клеточных агрегатов, которые имитируют морфологию и функции живых тканей и органов лучше, чем классические двухмерные культуры. В биологических и медицинских исследованиях применение 3D-культур становится все более популярным, поскольку они точнее отражают сложные физиологические условия и клеточные взаимодействия. Это делает их ценным инструментом для изучения различных аспектов клеточной биологии, патологии и лекарственного воздействия.

Существует несколько типов трехмерных культур: сфероиды, органоиды и биопринты.

Сфероиды представляют собой агрегаты клеток, выращенные в трехмерной форме, обычно в виде шарика или капли. Они создаются путем культивирования клеток в условиях, стимулирующих самоорганизацию в трехмерные структуры, например, в низкоадгезионных плашках с круглым дном, в висячей капле жидкости или в толще геля из внеклеточного матрикса либо из других биосовместимых материалов. Сфероиды могут быть однотипными, состоящими из одного типа клеток, или гетерогенными – из нескольких типов. Они используются для изучения биологических процессов, таких как клеточная миграция, инвазия, дифференциация и реакция на лекарственные препараты.

Органоиды – это структуры, подобные органам, которые образуются из клеток, выращенных в трехмерном пространстве. Они представляют собой миниатюрные версии органов, воспроизводят их основные архитектурные и функциональные характеристики. Органоиды создают из стволовых клеток или тканевых культур и используют для изучения биологических процессов, а также для моделирования заболеваний и тестирования лекарственных препаратов.

Биопринты представляют собой трехмерные структуры, созданные с использованием биоматериалов и различных методов 3D-печати – экструзионной или лазерной биопечати. Биопринты имитируют различные ткани и органы и применяются для создания биологических аналогов, которые могут быть использованы в исследованиях, лечении и трансплантации.

Основные виды применения 3D-культур

1. Моделирование тканей и органов in vitro. 3D-культуры используются для создания реалистичных моделей тканей и органов (печени, сердца, почек, кишечника и др.). Эти модели позволяют изучать структуру и функции тканей и органов, а также исследовать биологические процессы и патологии, оценивать реакцию клеток на различные стимулы и лекарственные препараты в трехмерном микроокружении.