Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Концентрация углекислого газа (CO₂) в инкубационной среде играет ключевую роль в регуляции pH среды и влияет на множество клеточных процессов, включая дыхание, рост и метаболизм. Поддержание оптимального содержания CO₂ в воздухе инкубатора является важным аспектом успешного культивирования клеток. Обычно оптимальное содержание CO₂ в инкубационной камере составляет около 5–10 %, что примерно соответствует уровню углекислого газа в крови и тканевой жидкости человека. Буферные системы питательной среды подбираются таким образом, чтобы поддерживать оптимальное значение pH именно при этом уровне CO₂. Недостаточное содержание CO₂ может привести к алкалозу (защелачиванию) среды, в то время как избыточное содержание CO₂ может вызвать ацидоз (закисление). Для поддержания оптимального содержания CO₂ используют специальные инкубаторы, которые настраивают на нужный уровень CO₂. Обычно инкубаторы оснащены системами регулирования, автоматически поддерживающими заданное содержание CO₂ путем подачи газа из подключенного баллона или удаления газа из камеры. Кроме того, в среды нередко добавляется индикатор, позволяющий отслеживать значимые изменения pH среды. Например, чаще всего используемый феноловый красный придает среде красный цвет, при закислении желтеет, а при защелачивании становится фиолетовым.

Помимо температуры, влажности и содержания CO₂, на успешное культивирование клеток оказывает влияние ряд других факторов, например, освещение может воздействовать на клеточный метаболизм и функционирование клеток. Некоторым клеткам для оптимального роста и размножения требуется определенный режим светового цикла или определенная интенсивность света. Большинство же клеточных линий выращивается в инкубаторах в отсутствие света. Хорошая вентиляция инкубационной камеры обеспечивает постоянное обновление воздуха и предотвращает накопление вредных газов и испарений. Концентрация кислорода в инкубационной камере также влияет на клеточный метаболизм и функции клеток. Некоторым клеткам необходима повышенная концентрация кислорода для оптимального роста и функционирования. Для других клеток или в рамках эксперимента может потребоваться создать гипоксию, т. е. сниженное количество кислорода. Существуют специальные инкубаторы, которые могут регулировать уровень кислорода, например, путем подключения к инкубатору источника азота, за счет чего происходит вытеснение излишнего кислорода для поддержания необходимого соотношения газов.

Высокий уровень шума и вибраций может оказывать негативное влияние на клеточный рост и функционирование. В связи с этим необходимо выбирать местоположение инкубатора таким образом, чтобы минимизировать воздействие внешних факторов. Кроме вышеперечисленных, существуют и другие факторы, влияющие на культивирование клеток, – гидродинамика среды, электромагнитные поля и т. д. Их важность и воздействие на клеточные процессы варьируются в зависимости от конкретных условий эксперимента.

Стерильность при работе с клеточными культурами

Стерильность играет решающую роль в культивировании клеток, поскольку любое загрязнение среды или культуральной посуды может привести к контаминации, что негативно скажется на результатах эксперимента.

Чаще всего при культивировании клеток используется культуральная посуда, простерилизованная производителем и поставляемая в герметичной упаковке для сохранения стерильности. Однако если необходимо использовать культуральную посуду повторно, то прежде всего ее нужно тщательно очистить, чтобы удалить все загрязнения и остатки предыдущих экспериментов, вымыв в теплой мыльной воде или с применением специальных моющих средств для удаления белковых отложений либо других загрязнений. После очистки культуральную посуду следует простерилизовать, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами и исключить риск контаминации клеточной культуры.

До использования посуда должна храниться в стерильных условиях, т. е. в стерильных пакетах либо в специальных шкафах или инкубаторах. Важно предотвратить и дальнейшее ее загрязнение микроорганизмами из окружающей среды. Для этого при работе необходимо соблюдать правила асептики – использовать перчатки, халаты, маски и защитные очки, а также проводить все манипуляции в стерильном ламинарном шкафу и/или чистом помещении.

Существует несколько методов стерилизации, которые могут быть использованы для обеззараживания инструментов, культуральной посуды и сред.

Автоклавирование: это один из самых распространенных способов стерилизации, при котором материалы подвергаются воздействию пара высокой температуры (чаще всего в диапазоне 120–132 °C) при повышенном давлении в автоклаве.

Химическая стерилизация: использование химических веществ, таких как спирт, перекись водорода, хлоргексидин и др., для уничтожения микроорганизмов.

Фильтрация: прохождение среды или растворов через микропористый фильтр (с размером пор 0,22 мкм и менее) приводит к фильтрации бактерий и даже вирусов.

Ультрафиолетовое облучение: ультрафиолетовое излучение используется для уничтожения микроорганизмов на поверхности инструментов и культуральной посуды.

Радиационная стерилизация: облучение (чаще всего гамма- и бета-излучение) применяется для промышленной стерилизации одноразовых изделий из полимерных материалов.

Для поддержания стерильности во время культивирования клеток необходимо соблюдать следующие меры предосторожности:

• работать в чистой и стерильной среде, например, в ламинарном потоке в специальных боксах;

• использовать стерильные инструменты и культуральную посуду;

• периодически проверять эффективность стерилизации и обеззараживания оборудования, например, бактериологическими методами;

• избегать контакта нестерильных поверхностей с культуральной средой или клетками.

Для сдерживания роста небольшого количества микроорганизмов, которые могут попасть в культуральную среду при работе с клетками, используются растворы антибиотиков (антибактериальных средств) и/или антимикотиков (противогрибковых средств), однако они не смогут предотвратить рост микроорганизмов при избыточном попадании или при контаминации резистентными штаммами. Кроме того, в ряде экспериментов антибиотики и антимикотики недопустимы.

Регулярное обновление навыков и техник стерильной работы и соблюдение правил стерильности являются важнейшими аспектами успешного культивирования клеток. Это подразумевает и обучение персонала, и обновление протоколов и процедур в соответствии с последними рекомендациями и стандартами, которые содержатся в нескольких авторитетных источниках. Вот некоторые из них.

1. Американская ассоциация клеточной биологии (American Society for Cell Biology, ASCB) предоставляет рекомендации и образовательные ресурсы по различным аспектам клеточной биологии, включая культивирование клеток.

2. Европейская фармакопея (European Pharmacopoeia) публикует стандарты, которые включают методы контроля качества клеточных культур, используемых в медицинских и фармацевтических исследованиях.

3. «Американская коллекция типовых культур» (American Type Culture Collection, ATCC) устанавливает стандарты и протоколы культивирования клеток, а также тестирования на контаминацию.

4. Международная организация по стандартизации (International Organization for Standardization, ISO) публикует стандарты, касающиеся биотехнологий и лабораторной практики, в том числе ISO 9001 и ISO 13485, которые относятся к системам менеджмента качества в биотехнологической и медицинской промышленности.

5. «Стандарты надлежащей лабораторной практики» (Good Laboratory Practice, GLP) регламентируют процессы и процедуры для обеспечения надежности и воспроизводимости результатов исследований, включая культивирование клеток.

6. «Стандарты надлежащей производственной практики» (Good Manufacturing Practice, GMP) регламентируют производственные процессы в биотехнологии и фармацевтике, в том числе стерильные техники и контроль качества клеточных культур.

7. Национальные институты здравоохранения США (National Institutes of Health, NIH) предоставляют руководства и стандарты по различным аспектам биомедицинских исследований, включая культивирование клеток и предотвращение контаминации.

8. Федеральное агентство по контролю за продуктами и лекарствами США (Food and Drug Administration, FDA) публикует руководства и стандарты, касающиеся использования клеточных культур в медицинских исследованиях и производстве.

Эти рекомендации и стандарты помогают поддерживать высокий уровень стерильности и качества в процессе культивирования клеток, способствуют надежности и воспроизводимости результатов исследований.

В случае возникновения контаминации необходимо немедленно принять меры по ее устранению, такие как удаление зараженных культур и поверхностей, проведение дополнительных процедур стерилизации и анализ источников заражения для предотвращения повторного возникновения проблемы.