Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии: читать начало книги онлайн

Качество кристалла зависит не от того, насколько аккуратно он выглядит, а от того, насколько хорошо он рассеивает рентгеновские лучи. Как я упомянул в главе 3, разрешение позволяет судить, насколько близко расположены два участка, которые не наслаиваются друг на друга. На практике о качестве разрешения кристалла можно судить, рассмотрев, насколько велика градусная мера угла, на которую распространяются в стороны от входящего пучка пятна рентгеновской дифракции.

Плохой кристалл дает всего несколько дифракционных пятен по бокам от основного рентгеновского пучка, позволяющих составить лишь общие представления о его форме. В более качественных кристаллах, обеспечивающих разрешение 5–7 ангстрем, можно рассмотреть некоторые черты белков (одноцепочечные альфа-спирали в виде трубочек), ДНК и РНК (бороздки в спиралях). В кристаллах с хорошей дифракцией пятна видны под очень широкими углами, вплоть до теоретического предела, связанного с длиной волны рентгеновского излучения. (Как вы помните, невозможно рассмотреть детали, удаленные друг от друга менее чем на половину длины волны.) На данном пределе у простых молекул, например солей, просматриваются отдельные атомы, напоминающие шарики. Но для белков практически никогда не удается достичь разрешения в 1 ангстрем, возможного для молекул. А по мере того как молекулы становятся все крупнее и гибче, они редко приобретают при кристаллизации форму, обеспечивающую высокое разрешение при дифракции: чем больше угол охвата, тем более размытыми становятся дифракционные пятна, пока, наконец, совсем не исчезают. Соответственно, чем больше угол, в рамках которого просматриваются дифракционные пятна, тем выше разрешение структуры. В среде специалистов принято говорить и о разрешении кристалла, и даже о разрешении конкретного дифракционного пятна.

Имея разрешение выше 3,5 ангстрем, можно определить атомную структуру, поскольку на данном уровне начинают просматриваться характерные черты аминокислот и оснований. Аминокислоты, входящие в состав белков, отличаются по форме: бывают большие и плоские, длинные и тонкие или обрубленные. Если знать порядок, в котором они должны идти, можно составить белковую цепочку, ориентируясь на контуры аминокислот, словно вы собираете большой трехмерный пазл. Аналогично, в ДНК и РНК, основания Т (U) и С – маленькие, а основания А и G – большие. Химическую структуру молекул на таких картах можно воссоздать с точностью до атомов, но при сборке возможны ошибки, поскольку у нас нет правильного ответа – полной картины, которую размещают на коробочке с пазлом.

Итак, есть пороговое значение примерно в 3,5 ангстрем. Если добиться более высокого разрешения, вы, вероятно, сможете разгадать атомную структуру, а при разрешении ниже 4 ангстрем это будет непросто, если только вы уже не представляете в общих чертах, как именно выглядит молекула.

Первые кристаллы рибосом были ужасного качества и практически не давали дифракционных пятен. Но Аду Йонат это не смущало. Вместе со своим давним коллегой Франсуа Франчески, который курировал опыты по кристаллизации в Берлинском институте, она настойчиво продолжала синтезировать все более качественные кристаллы. Кроме того, Ада вела исследования у себя в лаборатории в Институте Вейцманна в Израиле. На тот момент израильские ученые открывали новые виды животных, чтобы точнее охарактеризовать локальное биоразнообразие. В частности, они обнаружили микроорганизм под названием Haloarcula marismortuii. Эта бактерия существует в суровых условиях экстремально соленого Мертвого моря, то есть является экстремофилом. Позже выяснилось, что Haloarcula – не бактерия, а архея и по сложности рибосом занимает промежуточное положение между бактериями и эукариотами. Ада подумала, что стоит кристаллизовать рибосомы этого организма. Большие субъединицы из них действительно кристаллизовались качественнее, чем какие-либо другие, но их атомную структуру Ада смогла разгадать только после многократного регулирования условий выращивания кристаллов.

Вместе с тем существовала проблема снятия данных. Как правило, кристалл вращают, подставляя его под пучок рентгеновских лучей, чтобы сделать серию снимков и измерить рассеянные рентгеновские лучи в детекторе. При любой ориентации кристалла некоторые его плоскости будут удовлетворять закону Брэгга и давать дифракционные пятна в определенных направлениях. Собрав все возможные пятна, вы получите данные для вычисления структуры кристалла.

Работать с кристаллами рибосом было особенно сложно, поскольку дифракционные пятна от них были слабыми. Дело в том, что выраженность пятен зависит от количества молекул (пятно – результат общего вклада лучей, рассеянных от молекул), каковых в рибосомах больше, чем в типичных белках. Чтобы рассмотреть кристалл целиком, требовалось надолго подставить его под интенсивный пучок рентгеновских лучей, вызывающий в молекулах изменения их внутренней структуры и позиции, а также впускающий в структуру свободные радикалы. След рентгеновского луча на крупном кристалле имеет особый оттенок, дифракционные пятна под большим углом тускнеют и исчезают, пока идет облучение.

Кристаллографы говорят, что кристалл «погибает» в рентгеновских лучах. При работе с маленькими белковыми молекулами можно собрать достаточную информацию с одного кристалла, либо, если он стал «погибать», переходить к новым кристаллам, пока все интересующие данные не будут собраны. В случае с кристаллом рибосомы не удается собрать воедино даже первую дифракционную картину: еще до завершения подготовки первого снимка некоторые пятна уже могут исчезнуть.

Наконец ученые догадались, что, если охлаждать кристаллы, то удастся замедлить диффузию свободных радикалов, возникающих под действием рентгеновских лучей, и снизить ущерб. Первые реальные доказательства о работоспособности такого механизма дали Дэвид Хаас, на тот момент – постдок в Институте Вейцманна в Израиле, и Майкл Россманн из Университета Пердью. Как и многие представители своего поколения, Россманн начал карьеру в LMB, работая у Макса Перуца над изучением первых структур гемоглобина. Сегодня он светило науки. Ему уже за восемьдесят, но он успешно руководит группой и ведет столь активный образ жизни, что, говорят, до сих пор поднимается в горы быстрее своих пост-доков и студентов. Хаас и Россманн решили остудить кристаллы фермента до –75 °C и обратили внимание, что дифракционные пятна от них стали исчезать значительно медленнее. Но кристаллы, наполовину состоящие из воды и выглядящие правильными, на деле оказываются дряблыми, как медуза, или рассыпчатыми, как сыр. Белковые молекулы имеют неправильную форму, между ними мало точек соприкосновения и много водных «проток», которые при сильной заморозке превращаются в лед и распирают кристалл. Грег Пецко, на тот момент работавший в MIT, заменил водный раствор в кристаллах своеобразным антифризом.

По каким-то причинам эти методы еще долго не могли закрепиться – возможно, потому, что плохо поддавались обобщению. Первыми на них обратили внимание специалисты по электронной микроскопии, чьи препараты также подвергались электронному облучению. Жак Дюбоше, работавший в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге, обнаружил, что, если быстро бросать образцы в жидкий этан, вода не успевает превращаться в лед. Она витрифицировалась (становилась похожей на стекло), сохраняя биомолекулы в естественном состоянии.

Тем временем норвежец Хокон Хоп, работавший в Калифорнийском университете в Дэвисе, занимался сбором данных на материале нескольких мелких органических молекул, легко окислявшихся при комнатной температуре.

Вероятно по примеру Дюбоше, он догадался остудить кристаллы в масле и быстро кидать их в жидкий пропан. Как он и надеялся, структура кристаллов сохранялась. Хотя теперь этот процесс именуют «замораживанием», а кристаллы называют «замороженными», важно помнить, что данный метод является действенным именно потому, что вода не замерзает, а витрифицируется.

Рис. 7.2. Джоэл Суссман, Феликс Фролов и Хокон Хоп проводят один из первых экспериментов по охлаждению кристаллов в Институте Вейцманна (публикуется с разрешения Джоэла Суссмана)

Хокон побывал в Институте Вейцманна в Израиле и там познакомился с Джоэлом Суссманом, который поинтересовался, может ли Хоп приспособить свой метод для работы с биомолекулами. Хокон вернулся домой и применил свой подход к двум очень мелким белкам. Затем он вновь отправился в Институт Вейцманна и стал работать вместе с Джоэлом и его коллегой Феликсом Фроловым, стараясь сделать этот метод универсальнее. Среди первых кристаллов, с которыми они попытались работать, был кристалл ДНК, исследованием которого занимался студент Джоэла, Леемор Джошуа-Тор. После первых успехов они успешно применили это на нескольких других проектах.

Ада, работавшая в Германии, время от времени возвращалась в свою лабораторию в Институте Вейцманна. В какой-то момент Хокон и другие сотрудники из лаборатории Джоэла убедили Аду попробовать метод охлаждения, чтобы облегчить ей сбор данных о кристаллах рибосом. Поначалу она отнеслась к этому скептически, поскольку для работы с рибосомами требовалось интенсивное рентгеновское излучение из синхротрона, на приборах которого в те времена было нестандартное охлаждающее оборудование. В конце концов Аде и Хокону выделили немного времени, чтобы они могли собрать данные в Стэнфордском синхротронном радиационном центре, расположенном всего в паре часов пути от лаборатории Хокона в Дэвисе. Хокон сложил охлаждающее оборудование себе в машину, поехал в Стэнфорд и сам там все установил. По его свидетельству, первый эксперимент по замораживанию прошел весьма хорошо, ему удалось увидеть красивый дифракционный узор со множеством пятен. Следующие десять с лишним попыток провалились, но он не отступался, пока, наконец, не добился надежного протекания эксперимента. Как только этот метод сработал с кристаллами рибосом, Ада стала пропагандировать такой подход, названный криокристаллографией.

Несмотря на успех, метод был широко воспринят лишь спустя некоторое время, поскольку требовал кропотливого размещения кусочка кристалла длиной не более десятой доли миллиметра между двумя крошечными кварцевыми пластинами, наклеиваемыми на кончик иголочки. В 1990 году Цюй-Йи Тэнь из Корнелла изобрел простую процедуру, в ходе которой кристалл выуживался из капельки при помощи крошечной гибкой петли на кончике иголки, и жидкость держалась в петле под действием поверхностного натяжения.

Рис. 7.3. Кристалл рибосомной субъединицы 30S, охлажденный в петле. Полосы показывают области, которые были подвергнуты рентгеновскому излучению. Кристалл имеет длину около 0,3 мм и ширину менее 0,1 мм

Упрощение метода обеспечило криокристаллографии всемирное признание. В науке часто бывает, что продемонстрировать выигрышность метода недостаточно, надо еще показать, что он удобен на практике.

Первые кристаллы из субъединицы 50S от H. marismortuii получились заметно лучше любых добытых ранее. После систематической доработки условий эксперимента Ада с коллегами смогли рассмотреть дифракционные пятна размером до 3 ангстрем. Это было значительно выше порога, позволяющего воссоздать атомную структуру. Когда о результатах было сообщено в Journal of Molecular Biology, мой творческий отпуск только начинался, и я сразу понял, насколько знаковая это статья, и с воодушевлением представлял, что атомная структура большой субъединицы нам поддалась.

С этим контрастировал другой факт: к 1991 году уже несколько лет как были получены кристаллы рибосомных субъединиц и даже целых рибосом, и, пусть они и не давали дифракции со столь высоким разрешением, на их основе все равно можно было построить молекулярные карты, которые позволили бы как минимум в общих чертах сориентироваться в расположении отдельных белков и РНК. Тем не менее таких карт еще не существовало. Я задумался: чем же теперь займется Ада?

Очень скоро я увидел положение дел. Раз в несколько лет крупнейшие исследователи рибосом съезжаются куда-нибудь на общую встречу, чтобы сверить курс текущих работ. Ближайшая подобная встреча планировалась в Берлине сразу после моего отпуска. Повод для нее был печальный: ушел из жизни Виттманн, так много сделавший, чтобы превратить Берлин в мировой центр изучения рибосом. Организовывать конференцию взялся его коллега Кнуд Нирхаус.

Белок S5, который я расшифровал в период отпуска, был крошечным фрагментом рибосомы, но являлся первой рибосомной атомной структурой, выстроенной за последние несколько лет. Я никогда ранее не бывал на таких собраниях, но Стив Уайт великодушно позволил мне рассказать об этой работе. Почти ничего с той встречи не помню; складывалось впечатление, что крупных достижений в исследовании структуры целой рибосомы там не упоминалось – таких, о которых я бы еще не читал.

Возвращение в Брукхейвен меня разочаровало. После года, проведенного в LMB, контраст казался разительным. В некоторых отношениях Брукхейвен до странности напоминал LMB: ученые работали небольшими командами и ставили опыты самостоятельно, а не управляли сотрудниками; кроме того, работа стабильно финансировалась Министерством энергетики. Но бюрократы из министерства едва ли сочувствовали такой «мелкой» науке, не сулившей никаких реальных прорывов в биологии. Те немногие ученые, что работали в министерстве, как правило, специализировались в физике и расценивали государственные лаборатории как площадки для крупных агрегатов – скажем, реакторов или ускорителей частиц. В результате приходилось наблюдать, как биологическому отделу, где делалась первоклассная наука, понемногу перекрывали финансирование, и туда становилось все сложнее привлекать яркие молодые кадры, без которых любой институт теряет жизнеспособность.

Через несколько месяцев после возвращения я предложил Ричарду Хендерсону, на тот момент возглавлявшему в LMB отдел структурных исследований, свою кандидатуру для работы под его началом. Он ответил, что всем им понравилось иметь со мной дело, но у них пока нет для меня открытых вакансий. Я счел это вежливым отказом.

Примерно в то самое время Уэс Сундквист, вместе с которым мы работали за одним столом в кембриджской лаборатории, пригласил меня в Солт-Лейк-Сити, где он только что поступил в коллектив преподавателей Университета Юты. Там собралась пестрая компания молодых сотрудников-энтузиастов и известных маститых ветеранов. Сам университет находился в живописной местности среди гор. Поэтому, когда он спросил, интересует ли меня штатная позиция в этом университете, я просто загорелся.

В тот самый период открылись еще две вакансии, но, учитывая коллектив, расположение и хорошее жалованье, я склонялся к Юте. Тогда и ожили все мои страхи о финансировании. В Брукхейвене, даже если не удавалось обзавестись внешними грантами, тебе платили зарплату и выделяли средства на научную работу, к которой можно было привлечь одного-двух лаборантов. В университете ты полностью зависел от федеральных грантов, и мне просто кошмары снились о том, что будет, если я их потеряю и моя карьера покатится под откос. Поэтому я сообщил Дане Кэрроллу, руководителю из Юты, отнесшемуся ко мне исключительно тепло и приветливо, что сожалею, но все-таки в Юту не приеду. Его это не обрадовало.

Но вскоре после этого со всей четкостью проявилось, что сулит Брукхейвен. Кроме проблемы с урезанием финансирования, нужно было признать, что нам с Верой было неуютно жить на Лонг-Айленде и переносить здешнее жаркое влажное лето и холодные промозглые зимы: моя астма обострялась. С некоторым покаянием я вновь позвонил Дане и спросил: «А можно мне все-таки передумать?» Он великодушно согласился, но подчеркнуто заметил, что на этот раз «колебания не принимаются».

Одна из причин моего изначального отказа заключалась в том, что у меня в голове уже постепенно прорастали семена одной идеи, но она казалась настолько рискованной, что я предпочитал подстраховаться от сюрпризов в профессиональной жизни, чтобы у меня хватило сил взяться за воплощение этой идеи. Во время творческого отпуска я воспользовался MAD-методом для расшифровки глобулярного домена гистона H5 (GH5, о котором я говорил ранее) и удивился, как же такой слабый аномальный сигнал, рассеивающийся от атома селена, позволяет получать такие красивые карты. Можно ли при помощи такого метода разгадать какую-нибудь поистине гигантскую структуру, такую как рибосома? Оказалось, что в рибосомах не так много метиониновых остатков, поэтому сигнал получится слишком слабым.