Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии: читать начало книги онлайн

Глава 6

Возникновение из первозданной дымки

В отпуске я прочитал две статьи, изменившие мой подход к рибосоме. Одна из них была связана со старинным парадоксом «курица или яйцо?» и посвящена вопросу, как вообще могли возникнуть рибосомы. Сегодня вся жизнь зависит от тысяч реакций, протекающих с участием белков. Рибосома как состоит из белков, так и производит их. В статье 1968 года Крик предположил, что тРНК и рибосомная РНК «входили в состав примитивного механизма для синтеза белков <…> так и хочется спросить: а могла ли примитивная рибосома полностью состоять из РНК?»[13]

К моменту, когда Крик высказал это предположение, все известные ферменты – имеющиеся в каждой клетке биомолекулы, катализирующие жизненно важные химические реакции, – являлись белковыми. Нуклеиновые кислоты могли считаться не более чем инертными носителями информации, не выполняющими никаких химических реакций, тем более трансляцию генов в белки. К тому моменту были открыты и другие ферменты, в работе которых участвуют ДНК и РНК – например, копирующие ДНК при делении клетки или синтезирующие мРНК, соответствующую (комлиментарную) ДНК.

Создавалось впечатление, будто рибосомная РНК напоминает строительные леса, на которых подвешиваются различные белки, каждый из которых выполняет в рибосоме какую-то задачу. Так, один белок может помогать тРНК расшифровывать код, другой – добавлять аминокислоты к растущей белковой цепочке и т. д. Таким образом удавалось объяснить, зачем рибосомных белков так много.

Еще с 1950-х было известно, что принцип действия многих антибиотиков заключается в блокировании рибосом. Номура показал, что мутантные бактерии, устойчивые к стрептомицину, имеют измененный рибосомный белок. Мутации в других белках также меняли реакцию рибосомы на антибиотики.

Тогда многие ученые сосредоточились на исследовании белков, но нашлись и такие, которых интересовала именно рибосомная РНК. Например Гарри Ноллер, которого я в шутку называл Мудрецом из Санта-Круса. Гарри носил длинную бороду, одевался обычно в джинсы и футболку и мог сойти по манерам за благодушного калифорнийского хиппи. Еще он увлекался мотоциклами и винтажными «феррари» (даже свои компьютеры он называл в честь итальянских гонщиков). Харизма и ирония Ноллера гарантировали ему обожание со стороны молодых ученых – так, на некоторых собраниях они стайкой окружали его, как фанаты рок-звезду. Но под всей этой мишурой он был серьезным и исключительно амбициозным человеком, напористо изучавшим рибосомы.

Уроженец Калифорнии, он получил высшее образование в Беркли, после чего отправился писать докторскую диссертацию по химии белков в Орегон. Затем стал постдоком в LMB. Там под руководством Иуана Харриса он занимался исследованием одного белка, участвующего в расщеплении глюкозы. В автобиографическом эссе он повествует, как его слегка испугала одна ситуация на вечеринке в некоем кембриджском колледже, когда к нему подошел Сидни Бреннер и поинтересовался, кто он такой и что здесь делает. Узнав, что Гарри работает над глицеральдегидфосфатдегидрогеназой, Бреннер заявил: «Это же ерунда! Если вы – биохимик по белкам, почему вы не занимаетесь чем-нибудь интересным, например рибосомами?» При этом сам Бреннер не считал рибосомы чем-то настолько важным, чтобы самостоятельно изучать их в LMB.

Поначалу Гарри был просто сокрушен такой уничижительной оценкой. Но ему хватило смелости признать правоту Бреннера и покинуть Кембридж, чтобы отправиться в Женеву и работать там с Альфредом Тиссьером. Там он ненадолго пересекся с Питером Муром, который совершал точно такой же европейский вояж, но в противоположном направлении: сначала попал в Женеву, а потом оказался в Кембридже. Питер сказал, что Гарри взяли на работу в Женеву благодаря опыту в работе с белками, чтобы он помог их очистить и охарактеризовать.

Когда Гарри вернулся в Калифорнию и взялся за руководство собственной лабораторией в Санта-Крусе, он поставил ключевой эксперимент, изменивший весь ход его жизни. Он и его студент Джонатан Чейрз продемонстрировали, что если изменить рибосомную РНК в малой субъединице при помощи вещества под названием кетоксал, то она перестанет связываться с тРНК. Это был первый признак, что рибосомная РНК на самом деле может выполнять некую важную функцию. Многие ученые расценили прорыв как просто любопытный факт, но Гарри довел это исследование до конца.

В начале 1980-х в науке произошло важное событие, спровоцированное двумя учеными: Томом Чеком из Колорадо и Сидни Олтменом из Йеля. Чек искал фермент, отвечающий за реакцию, при которой отрезок РНК может самостоятельно отделяться от более длинного фрагмента. Олтмен, в свою очередь, изучал свойства фермента, способного расщеплять определенные молекулы РНК. Сам этот фермент представлял собой комплекс из белка и РНК, и, к удивлению Олтмена, оказалось, что сама ДНК-составляющая могла выполнять реакцию расщепления. Итак, группы обоих ученых показали, что РНК как таковая может совершать химические реакции. Ферменты, состоящие из РНК, были названы рибозимами, чтобы отличать их от более распространенных белковых ферментов. Хотя реакции с их участием выглядят обособленно, они сыграли колоссальную роль в происхождении жизни.

Возникновение жизни – одна из великих тайн, которые еще хранит природа. Любая жизнь требует энергии и химически подходящей окружающей среды. Некоторые специалисты указывали, что жизнь с точки зрения химии напоминает реакцию около геотермальных источников на дне океана. Но фундаментально жизнь – это не просто набор химических реакций; это механизм хранения и воспроизводства генетической информации, развивающий сложные организмы из более примитивных. Вирус тоже относится к живым существам, хотя многие в этом сомневаются, поскольку для размножения ему необходима клетка-хозяин.

Практически у всех живых организмов генетическая информация передается через ДНК, но сама ДНК инертна и собирается при помощи множества белковых ферментов, для синтеза которых требуется участие не только РНК, но и рибосом.

Чек и Олтмен показали, что РНК способна выступать носителем информации в виде последовательности оснований (как и ДНК), а также обеспечивать химические реакции, как это делают белки. Сегодня известно, что элементарные составляющие РНК можно получить из самых простых химических веществ, которыми Земля богата уже миллиарды лет. Поэтому вполне возможно представить, как жизнь могла зародиться из множества разных молекул РНК, которые потом «научились» самовоспроизводиться. Как только это произошло, эволюция и естественный отбор открыли путь к синтезу более сложных молекул, в конце концов породив нечто столь сложное, как первые рибосомы. В этом состоит идея «мира РНК» – этот термин, предложенный Уолли Гилбертом, прижился и стал популярен.

Возможно, рибосомы зародились в мире РНК и синтезировали белки, которые лучше РНК справились с большинством реакций за счет аминокислот. Таким образом, белки не только взяли на себя большинство функций РНК, но и стали решать новые задачи. Это также объясняет, почему, при всем изобилии РНК в рибосоме, те ферменты, которые реплицируют ДНК или синтезируют РНК на ДНК в качестве матрицы, сейчас полностью состоят из белков. Вероятно, дело в том, что ДНК стала использоваться для хранения генов позже, когда белки в клетке уже преобладали и отвечали за большинство протекающих в ней реакций.

Но это не объясняет, как появились гены. Наиболее правдоподобная версия такова: первые примитивные рибосомы собирали лишь короткие пептидные участки, которые помогали оптимизировать окружавшие их ферменты РНК. Но появление генов, кодирующих инструкции для синтеза белков, позволяющих сшивать аминокислоты в строго определенном порядке, все равно остается необъяснимым прорывом. Поскольку тогда наряду с большой субъединицей должно было возникнуть и множество других элементов: мРНК для передачи генетического кода, тРНК для доставки аминокислот и малая субъединица, которая стала бы служить платформой для связки мРНК и тРНК. До открытия катализа РНК оставалось непонятным, как могла зародиться такая система.

Почему именно РНК, а не ДНК, могла выполнять реакции? Основное отличие между ними заключается в наличии атома кислорода в рибозе (входящей в состав каждого нуклеотида РНК), который позволяет образовывать гидроксильную группу (OH). Теперь нам известно, что OH-группы из различных участков РНК могут связываться друг с другом и таким образом формировать трехмерные структуры наподобие белковых ферментов, образуя «карманы», в которых протекают химические реакции.

После открытий Чека и Олтмена все осознали, что Крик, вероятно, был прав, предполагая, что первобытные рибосомы полностью состояли из РНК. Что же делают современные рибосомы?

Гарри стал искать химические модификации, не дававшие тРНК связываться с рибосомой. На тот момент никто еще даже не секвенировал рибосомную РНК. Вскоре после того как Гарри получил свои первые результаты, Фред Сэнгер из LMB научился секвенировать молекулы так, чтобы в точности определить порядок оснований в любом фрагменте ДНК, и за это получил вторую Нобелевскую премию (он – один из немногих, кто удостоен премии дважды). Тогда Гарри ненадолго вернулся в Кембридж, чтобы научиться секвенировать ДНК. Не пытаясь секвенировать РНК напрямую (эта задача и сегодня остается гораздо сложнее, чем аналогичная работа с ДНК), Гарри воспользовался методами Сэнгера, чтобы определить точную последовательность рибосомных РНК методом секвенирования их генов, расположенных в ДНК. Крупные участки рибосомной РНК из субъединиц 30S и 50S называются соответственно 16S и 23S РНК.

Сравнивания РНК-последовательности от разных видов, Гарри с Карлом Вёзе смогли выяснить их соотношение и принцип получения пар оснований. В рибосомной РНК много сегментов, имеющих форму двойной спирали. Вёзе пришел к выводу, что, кроме бактерий и эукариот, существует третий самостоятельный домен живых организмов – археи. Сегодня считается, что примитивные бактерии скрестились с древними археями и породили первые эукариоты (организмы, в клетках которых есть ядро). Археи, как и бактерии, являются прокариотами, то есть не имеют клеточного ядра. Затем из эукариот развились сложные многоклеточные организмы, в том числе люди.

После того как была отсеквенирована рибосомная РНК, Гарри решил определить место воздействия на молекулу химических агентов, изменявших ее. Он приспособил для этого метод, ранее разработанный для проверки места связи белков с ДНК, который состоял в обработке ДНК химическим реагентом до и после того, как с ней свяжется белок. Белок защищал те участки ДНК, с которыми связывался, и добавление реагента позволяло их измерить. Гарри и его студенты, среди которых следует особо отметить Данеша Моазеда, стали применять этот метод, именуемый футпринтингом, изучая рибосомную РНК. Они определили, какие ее участки связываются с молекулами тРНК и рибосомными белками. Но оставалось неясным, зачем части рибосомы соприкасаются друг с другом.

Футпринтинг с использованием антибиотиков оказался более интересен. Некоторые модифицированные белки обеспечивают резистентность рибосом к антибиотикам, но никому не удавалось «заставить» антибиотики напрямую связываться с рибосомными белками. При помощи футпринтинга Гарри доказал, что каждый антибиотик связывается с конкретным участком рибосомной РНК. Поскольку антибиотики блокируют работу рибосом, очевидно, что у рибосомной РНК должна быть некая важная функция. Так вся дисциплина была переориентирована на определение роли рибосомной РНК.

После длительного забвения рибосомы вновь вызвали интерес. Питер Мур в статье «Рибосома возвращается», опубликованной в Nature в 1988 году, писал: «Мода в биохимии изменчива. Открытие, показавшее, что некоторые РНК действуют как ферменты, оживило интерес к рибосомам, которыми долго пренебрегали»[14]. Но даже он не мог предположить, каким ярким станет возвращение рибосомы.

В 1992 году, к концу моего творческого отпуска, статья Гарри в Science пользовалась большой популярностью. Он пытался ответить на вопрос, что, кроме РНК-составляющей рибосомы, обладает способностью обеспечивать ключевую биохимическую реакцию синтеза полипептида (объединения двух аминокислот, между которыми образуется пептидная связь). Иными словами, является ли рибосома рибозимом? Он взял субъединицы 50S у бактерий Thermus, обитающих в гейзерах Йеллоустонского национального парка, и обработал их ферментом, переваривающим белки и разделяющим их на фрагменты. Затем он извлек максимум уцелевших белковых фрагментов. Полученные в результате субъединицы почти полностью состояли из РНК, но тем не менее могли поддерживать химическую реакцию.

Статья Гарри подняла большую шумиху в широком научном сообществе, но в целом этот результат не особо удивил тех, кто давно занимался рибосомами. Кроме того, он был не окончательным. Гарри изрядно потрудился, чтобы очистить субъединицу 50S от белков, однако в ней все равно оставалось немало белковых фрагментов, которые могли отвечать за реакцию. Когда Гарри применил иной метод, на этот раз полностью удалив все белки, частицы стали неактивны. Эта процедура не работала с рибосомами от E. coli, а именно с этой бактерией работало большинство специалистов. Сам Гарри исподволь признавал недостатки своей работы, озаглавив статью о ней весьма осторожно: «Необычная резистентность пептидил-трансферазы при процедурах извлечения белков». Несколько лет спустя (в 1998 году) группа японских специалистов, казалось, достигла цели, когда им удалось получить фрагменты чистой рибосомной РНК, способные поддерживать такую реакцию. Но после публикации результатов этого исследования в Science (опять же, с большой помпой) они обнаружили изъяны в своей работе и год спустя отозвали статью.

Было ясно, что по итогам сорокалетнего труда по разгадке секретов рибосомы одними лишь химическими методами ничего не оставалось, кроме как попробовать другие методы. В той самой статье, где Крик предположил, что первые рибосомы могли целиком состоять из РНК, он также отмечал: «Без более полного представления о структуре современных рибосом сложно высказать обоснованное предположение»[15].

Глава 7

Рубеж преодолен

Кроме статьи Гарри Ноллера из Science, мое внимание в период творческого отпуска привлекла и другая краткая заметка 1991 года: Ада Йонат сообщала, что ей удалось коренным образом улучшить кристаллы большой субъединицы. Впервые кристаллы вышли настолько качественными, чтобы на их основе можно было полностью определить атомную структуру целой рибосомной субъединицы, содержащей сотни тысяч атомов. Рубеж был пройден. Здесь необходимо пояснить, в каком случае кристалл можно считать достаточно качественным.

До сих пор мы опирались на то, что кристаллы образуются из молекул, укладывающихся ровными рядами в трехмерную структуру, именуемую кристаллической решеткой. Если молекула большая и гибкая, как белковая, то при кристаллизации она не примет в решетке ровно такую же ориентацию, что и соседствующие с ней молекулы. Итоговое изображение – это результат совокупного вклада миллионов отдельных молекул, образующих кристалл. Если все молекулы в кристалле расположены по-разному, то вклад каждой из них неясен. Для сравнения: представьте себе, как будут отличаться многократные фотографические экспозиции неподвижного и движущегося объектов.

Рис. 7.1. Дифракция и детализация, фиксируемая при разном разрешении

[13] Crick; 1968.

[14] Moor; 1988.

[15] Crick; 1968.