Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Подобные явления происходят при очень многих заболеваниях: синтезирующие клетки, секретирующие инсулин, разрушаются, когда у подростка развивается диабет 1 типа, клетки мозга погибают при болезни Альцгеймера, клетки ткани, из которых состоят хрящи, разрушаются при остеоартрите, и этот список можно продолжать бесконечно. Как было бы здорово, если бы мы могли заменять их новыми клетками, полностью идентичными нашим собственным. В этом случае мы могли бы навсегда забыть об отторжении тканей, с которым часто приходится сталкиваться при трансплантации органов, или об отсутствии так нужных нам доноров. Использование стволовых клеток таким образом называется терапевтическим клонированием; под ним мы подразумеваем создание клеток, идентичных клеткам конкретного больного, для лечения его заболевания.

Сорок с лишним лет мы знали, что теоретически это возможно. Работы Джона Гердона и его многочисленных последователей продемонстрировали, что взрослые клетки хранят в себе информацию обо всех клетках организма, и нам остается лишь найти эффективный способ извлечения ее. Джон Гердон брал ядра клеток взрослых лягушек, помещал их в яйцеклетки и закатывал эти ядра на самую вершину ландшафта Уоддингтона, создавая тем самым новых животных. Взрослые ядра оказывались — и это очень важное определение — перепрограммированными. Иэн Вилмут и Кит Кэмпбелл практически то же самое проделали с овцой. Важнейший общий признак, объединяющий эти работы, заключался в том, что в обоих случаях перепрограммирование срабатывало лишь тогда, когда взрослое ядро помещалось в неоплодотворенную яйцеклетку. Именно яйцеклетке была отведена в этом процессе главная роль. Мы не сможем клонировать живое существо, поместив взрослое ядро в клетку какого-либо другого типа.

Почему?

Чтобы разобраться в этом, нам придется сделать небольшое отступление и поговорить о биологии клетки. В ядре содержится подавляющее большинство ДНК и генов, которыми мы закодированы, это чертеж, по которому мы созданы. Очень незначительная часть ДНК располагается не в ядре — она находится в крошечных структурах, называемых митохондриями, но в данном случае это ничуть не должно нас беспокоить. Когда мы впервые знакомились с понятием клетки в школе, у большинства из нас складывалось впечатление, что самое главное и важное в ней — это ядро, тогда как все прочее, а именно цитоплазма, не более чем мешочек с жидкостью, пользы от которого не так уж и много. Трудно представить себе что-либо, столь же далекое от истины, и особенно, если речь идет о яйцеклетке, ибо и лягушки, и Долли научили нас тому, что цитоплазма в яйцеклетке играет ключевую роль. Что-то, содержащееся в этой яйцеклеточной цитоплазме, активно перепрограммировало взрослые ядра, помещенные в нее экспериментаторами. Эти неизвестные факторы откатили ядро со дна одного из уоддингтоновских желобов на самую вершину его ландшафта.

Никто толком не понимал, каким образом цитоплазме яйцеклетки удавалось преобразовывать взрослые ядра в ядра, присущие зиготам. Оставалось лишь предполагать, что, чем бы это ни было, оно должно быть невероятно сложным и запутанным для анализа. Часто в науке случается так, что действительно большие вопросы, получить ответы на которые не представляется возможным, содержат в себе ряд меньших вопросов, поддающихся осмыслению. Поэтому несколько лабораторий занялись решением концептуально более простых, но технически не менее сложных задач.

Давайте вспомним шарик на вершине ландшафта Уоддингтона. Пользуясь клеточной терминологией, мы называем его зиготой и характеризуем как тотипотентный, то есть обладающий потенциалом сформировать любую клетку в организме, включая и плаценту. Конечно, зиготы по определению крайне ограниченны количественно, и большинство ученых, занимающиеся исследованиями самых ранних стадий развития, пользуются клетками чуть более взрослыми, знаменитыми эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками. Эти клетки получаются в результате естественного процесса развития. Зигота дробится и делится несколько раз, образуя в итоге группу клеток, называемую бластоцистой. Несмотря на то, что бластоциста обычно насчитывает менее 150 клеток, она уже является эмбрионом на ранней стадии развития, состоящим из двух четко разделенных структур. В ней присутствует внешний слой, называемый трофэктодермой, из которой позже сформируется плацента и другие внеэмбриональные ткани, и внутриклеточная масса (ВКМ).

На рисунке 2.1 показано, как выглядит бластоциста. Рисунок выполнен в двух измерениях, однако в действительности бластоциста представляет собой трехмерную структуру, так что на самом деле она похожа на теннисный мячик, внутрь которого вклеен шарик для гольфа.

^{Рис. 2.1. Строение бластоцисты млекопитающих. Из клеток трофэктодермы образуется плацента. В процессе естественного развития клетки внутриклеточной массы (ВКМ) сформируют ткани эмбриона. В лабораторных условиях клетки ВКМ могут выращиваться в культуре как плюрипотентные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки будут делиться неограниченное количество раз, оставаясь при этом полным подобием своей родительской клетки. Их мы и называем ЭС клетками, и, как следует из их полного наименования, они способны сформировать любую клетку эмбриона и, в конечном итоге, взрослого животного. Они не тотипотентны — так как не могут образовать плаценту — и называются плюрипотентными, поскольку все остальное им по силам.}

Клетки ВКМ могут выращиваться в лаборатории в чашках для культивирования. Очень нежные и прихотливые, они требуют особых условий и крайне внимательного и бережного обращения, но соблюдайте правила, и они вознаградят вас за усердие тем, что ЭС клетки оказались поистине бесценными для понимания того, что необходимо для сохранения плюрипотентного состояния клеток. На протяжении долгих лет многие выдающиеся ученые, в первую очередь Азим Сурани в Кембридже, Остин Смит в Эдинбурге, Рудольф Джениш в Бостоне и Шинья Яманака в Киото, не жалея времени и сил, пытались идентифицировать гены и белки, экспрессированные (включенные) в ЭС клетках. Особые усилия они направляли на определение генов, поддерживающих ЭС клетки в плюрипотентном состоянии. Эти гены чрезвычайно важны, так как ЭС клетки демонстрируют высокую склонность к превращению в клетки других типов в культуре, стоит лишь чуть изменить условия их содержания. Допустите совсем незначительные вариации в выверенном режиме выращивания, и ЭС клетки, делящиеся в чашке для культивирования, тут же начнут дифференцироваться, например, в кардиомиоциты и заниматься тем, что лучше всего остального получается у клеток сердца: сокращаться в унисон друг с другом. Очередное едва уловимое изменение условий содержания, такое как, скажем, нарушение четкого баланса химических соединений в культуральной жидкости, может заставить ЭС клетки отказаться от их первоначального плана превратиться в клетки сердца и приступить к формированию клеток, из которых развиваются нейроны нашего головного мозга.

Ученые, работающие с ЭС клетками, определили огромное множество генов, играющих важную роль в сохранении клеток плюрипотентными. Функциональное назначение различных выявленных ими генов далеко не всегда было одинаковым. Некоторые из них были важны для самообновления, то есть одна ЭС клетка при делении образовывала две ЭС клетки, тогда как другие были необходимы для того, чтобы не позволять клеткам дифференцироваться[9].

Таким образом, к началу XXI века ученые обнаружили способ сохранения плюрипотентных ЭС клеток в чашках с культурой и узнали очень много нового и важного об их биологии. Кроме того, им удалось установить, как именно следует менять состав культурального раствора, чтобы находящиеся в нем ЭС клетки дифференцировались в клетки различных типов, включая клетки печени, сердца, нейроны и так далее. Но насколько это приближает нас к осуществлению мечты, о которой мы говорили выше? Смогут ли исследователи воспользоваться этой информацией, чтобы разработать новые способы обращения собственного времени клеток вспять, закатывания их вверх, в высшую точку уоддингтоновского ландшафта? Можно ли будет взять полностью дифференцированную клетку и обработать ее в лаборатории таким образом, чтобы она стала во всем подобной ЭС клетке, со всем присущим ей потенциалом? И если у ученых имелись веские основания полагать, что теоретически это возможно, то до осуществления этих идей на практике требовалось проделать еще очень и очень долгий путь. Однако эта работа сулила в высшей степени манящие перспективы для ученых, стремившихся с помощью стволовых клеток излечивать людей от самых разнообразных заболеваний.

К середине первого десятилетия нашего века было идентифицировано более двадцати генов, играющих важную роль в развитии ЭС клетках. Далеко не всегда ученым было понятно, каким образом они взаимодействуют между собой, и, конечно же, было совершенно ясно, что в биологии ЭС клеток для нас еще остается слишком много белых пятен. Однако абсолютно точно было известно то, что будет невообразимо сложно взять зрелую клетку и воссоздать в ней широчайший комплекс внутриклеточных условий, существующий в ЭС клетке.

Иногда величайшие научные прорывы случаются лишь по той причине, что кто-то попросту отваживается игнорировать превалирующий в каком-то вопросе пессимизм. В нашей истории оптимистами, решившими на практике проверить то, что все остальные по определению считали невозможным, были уже упоминавшийся выше Шинья Яманака и помогавший ему в проведении экспериментов докторант Казутоши Такахаши.

Профессор Яманака принадлежит к числу молодых светил в области изучения стволовых клеток и плюрипотентности. Родившийся в Осаке в начале 1960-х годов, он, что весьма необычно, занимал высокие академические посты в узкоспециализированных научно-исследовательских учреждениях Японии и США. Получив медицинское образование, он стал практикующим врачом в области ортопедической хирургии. Своих коллег-ортопедов другие хирурги часто снисходительно называют «мастерами кувалды и зубила». Хотя справедливого в этом определении мало, но все же практическая деятельность хирурга-ортопеда настолько далека от утонченной молекулярной биологии и изучения стволовых клеток, насколько это только можно себе представить.

Пожалуй, более любых других исследователей, занимавшихся изучением стволовых клеток, профессор Яманака горел желанием найти способ создания в лабораторных условиях плюрипотентных клеток из дифференцированных клеток. Приступив к этой работе, он располагал списком из 24 генов, имеющих жизненно важное значение для ЭС клеток. Все они принадлежали к числу «генов плюрипотентности» — они должны были оставаться активированными, чтобы ЭС клетки могли сохранить свою плюрипотентность. Если с помощью различных экспериментальных техник эти гены репрессировались, то ЭС клетки начинали дифференцироваться (как те самые сокращавшиеся клетки сердца в чашках с культурой) и уже никогда не возвращались к своему первоначальному состоянию ЭС клеток. Отчасти именно это и происходит в процессе естественного развития млекопитающих, когда клетки дифференцируются и становятся специализированными, — они «отключают» свои гены плюрипотентности.

Шинья Яманака решил проверить, не обратят ли некие комбинации этих генов биологическое время дифференцированных клеток вспять, не отодвинут ли их на более ранние стадии развития. Работа ему предстояла долгая и трудоемкая, причем имело место обоснованное опасение, что, если результаты окажутся отрицательными, то есть если ни одна из этих клеток не «откатится» в свое прошлое, то он не сможет узнать наверняка, в чем причина такого завершения экспериментов — в том, что это невозможно в принципе, или в том, что не были верно соблюдены условия проведения экспериментов. Это был рискованный проект даже для такого авторитетного ученого как Яманака, но еще больше подводных камней он таил в себе для его юного помощника Такахаши, поскольку тому только предстояло взбираться по лестнице своей научной карьеры.

Когда герцогу Веллингтону стало известно о возможности обнародования его личной интимной переписки, грозившей нанести ему значительный вред, он произнес свои ставшие крылатыми слова: «Публикуйте и катитесь ко всем чертям!» Мантра ученых практически такая же, однако она отличается одним очень важном нюансом. Для нас она звучит «публикуйте или катитесь ко всем чертям» — если вы не публикуете свои научные труды, то не получите для них финансирования и не найдете работу в университетах. И крайне немного шансов у вашей работы быть опубликованной в солидном научном журнале, если весь ваш рассказ о годах напряженного труда можно выразить в одной фразе: «Я старался, старался, но у меня ничего не получилось». Так что желание заняться проектом, имевшим относительно небольшую вероятность завершиться положительным результатом, с полным правом можно назвать отчаянно смелым поступком, а перед Такахаши, в частности, нам остается лишь снять шляпу.

Яманака и Такахаши, имея в своем распоряжении 24 гена, решили испытать их в клеточном типе, известном как МЭФ — мышиные эмбриональные фибробласты. Фибробластами называются основные клетки соединительной ткани, присутствующие в самых разнообразных органах, включая кожу. Извлечь их очень легко, и они быстро растут в культуре, поэтому представляют собой превосходный клеточный материал для проведения экспериментов. Поскольку клетки МЭФ, как следует из их названия, получают из эмбрионов, существовала надежда, что они, будучи помещенными в подходящую среду, вспомнят хоть немногое о своем происхождении и сумеют вернуться к более ранним стадиям собственного развития.

Помните, как Джон Гердон в своих экспериментах выбирал доноров и акцепторов среди лягушек разных групп, обладавших различными маркерами генетического кодирования, чтобы определить, какие именно ядра развиваются в новых животных? Нечто подобное проделал и Яманака. Он брал клетки у мышей, имевших предварительно добавленный лишний ген. Этот ген называется геном неомициновой резистентности (neoR) и действует в полном соответствии со своим наименованием. Неомицин — это принадлежащее к антибиотикам соединение, которое в обычных условиях убивает клетки млекопитающих. Но если клетки были генетически перестроены для экспрессии гена neoR, они выживут. Когда Яманака готовил мышь, необходимую ему для проведения экспериментов, он особым образом добавил ей ген neoR. Это означало, что ген neoR должен активироваться лишь в том случае, если клетка, в которой он находился, станет плюрипотентной. Эта клетка должна была повести себя так, как будто она стала ЭС клеткой. То есть, если эксперименты по насильственному возвращению фибробластов в состояние недифференцированной ЭС клетки окажутся успешными, клетки будут продолжать расти даже при добавлении в них летальной дозы антибиотика. Если же эксперименты завершатся неудачей, все клетки погибнут.

Профессор Яманака и доктор Такахаши ввели 24 гена, которые они хотели протестировать, в особые молекулы, называемые векторами. Эти молекулы исполняют роль троянского коня, доставляя в клетку высокие концентрации «дополненной» ДНК в фибробласты. Оказавшись в клетке, эти гены должны активироваться и начать вырабатывать специфические для каждого из них белки. Введение векторов может быть осуществлено довольно просто одновременно в большое количество клеток при помощи химической обработки или электрического импульса (никаких кропотливых микро-инъекций, только не для японских исследователей!) Когда Шинья Яманака вводил все 24 гена одновременно, некоторые клетки оживали после обработки их неомицином. Доля их была крошечной, но, тем не менее, это был впечатляющий результат. Из него следовало, что эти клетки активировали ген neoR. Они и начинали вести себя соответственно, как ЭС клетки. Но если он вводил гены поодиночке, ни одна клетка не выживала. Тогда Шинья Яманака и Казутоши Такахаши стали вводить в клетки различные комбинации из 23 генов. Результаты этих экспериментов они использовали для идентификации десяти генов, каждый из которых был необходим для создания неомицин-резистентных плюрипотентных клеток. Пробуя различные сочетания этих десяти генов, они, наконец, опытным путем определили минимальное количество генов, которые, действуя совместно, превращали фибробласты эмбриона в ЭС клетки.

Волшебное число оказалось четверкой. Когда в фибробласты вводились векторы, несущие в себе гены, называемые Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, происходило нечто совершенно невероятное. Клетки выживали в неомицине, демонстрируя тем самым, что они активировали ген neoR, и как следствие, становились подобными ЭС клеткам. И это не все — фибробласты начинали менять форму и внешне превращаться в ЭС клетки. Прибегая к разнообразным экспериментальным системам, ученые смогли преобразовать эти перепрограммированные клетки в три основных типа тканей, из которых формируются все органы млекопитающих — эктодерму, мезодерму и эндодерму. Именно это и проделывают обычные ЭС клетки. Фибробластам такое просто не по силам. Затем Шинья Яманака продемонстрировал, что он может повторить весь процесс, пользуясь в качестве исходного материала фибробластами взрослых мышей, а не эмбрионов. Это стало доказательством, что успех его метода не зависит от каких-то особенностей эмбриональных клеток, но может также применяться при работе с клетками полностью дифференцированных и зрелых организмов.

Созданные им клетки Яманака назвал «индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками», и аббревиатура этого термина — iPS (иПС) клетки — сегодня уже прочно укоренилась в профессиональном языке всех, кто занимается биологическими исследованиями. Если только представить, что каких-то пять лет назад этого словосочетания просто не существовало, а теперь оно пользуется всемирным признанием среди ученых, то мы поймем, насколько важен и велик был этот прорыв в науке.

Трудно поверить, что клетки млекопитающих несут в себе около двадцати тысяч генов, и всего лишь четыре из них необходимы для того, чтобы превратить полностью дифференцированную клетку в ее плюрипотентную предшественницу. При помощи этих четырех генов профессор Яманака сумел закатить шарик с самого дна одной из уоддингтоновских ложбин в верхнюю точку его ландшафта.

Нет ничего удивительного в том, что Шинья Яманака и Казутоши Такахаши опубликовали результаты своих открытий в журнале Cell («Клетка») — самом авторитетном и солидном в мире издании, посвященном биологическим исследованиям[10]. Что заставило слегка удивиться, так это последовавшая реакция. Все в 2006 году понимали, что это величайшее открытие, однако понимали они и то, что назвать его таковым можно лишь в том случае, если публикация в журнале соответствует истине. Очень многие ученые просто не могли поверить, что так оно и есть. Нет, они ни на мгновение не заподозрили профессора Яманаку и доктора Такахаши во лжи или в какой-либо подтасовке результатов. Они всего лишь усомнились, что исследователи сами не ошиблись в чем-либо при проведении экспериментов, потому что не может быть все настолько просто. Это можно сравнить с тем, что человек, решивший найти Святой Грааль, обнаружил его уже на второй минуте поисков под пакетом с зеленым горошком у задней стенки собственного холодильника.

Вполне очевидное развитие событий, казалось бы, напрашивалось само собой — кто-нибудь должен повторить работу японских ученых и посмотреть, получатся ли у него такие же результаты. Для читателя, не занимающегося наукой профессионально, это может показаться странным, но лаборатории не помчались наперегонки друг с другом в стремлении первыми повторить исследования своих коллег. Шинья Яманака и Казутоши Такахаши потратили два года на проведение экспериментов, которые были в высшей степени трудоемкими и требовавшими скрупулезной точности на каждой их стадии. Другие лаборатории, кроме того, были жестко привязаны к проведению собственных исследовательских программ и не горели особым желанием отвлекаться от них. Еще одним препятствием было то, что организации, выделяющие исследователям средства для осуществления конкретных проектов, мягко говоря, не приходят в восторг, если сотрудники лабораторий вдруг забрасывают утвержденную программу исследований и начинают заниматься чем-то совершенно посторонним. Особенно неприятно и опасно в такой ситуации то, что конечные результаты могут оказаться негативными. На практике это означало, что только располагающая неограниченными финансовыми ресурсами и оснащенная по последним требованиям лаборатория с очень уверенным в себе руководителем может задуматься о том, чтобы «тратить время» на воспроизведение и повторение чьих-то экспериментов.

Рудольф Джениш из института Уайтхеда в Бостоне по праву считается колоссом в области создания генетически модифицированных животных. Родившийся в Германии, вот уже почти тридцать лет он работает в Соединенных Штатах. Обладатель вьющихся седых волос и впечатляющих усов, он сразу же приковывает к себе взгляды участников любых конференций. Может быть, и неудивительно то, что именно он стал тем ученым, который отважился отложить выполнение собственных исследовательских проектов и лично убедиться в том, что Шинья Яманака действительно осуществил невозможное. В конце концов, ему принадлежит следующее общеизвестное высказывание: «На протяжении многих лет я брался за многие рискованные проекты, поскольку считаю, что, если вам пришла блестящая идея, вы просто обязаны учитывать возможность неудачи и продолжать эксперименты».

На конференции в Колорадо в апреле 2007 года профессор Джениш выступил с докладом, в котором сообщил, что ему удалось повторить эксперименты Яманаки. Результаты совпали. Яманака был прав, iPS клетки действительно могут быть созданы при введении всего лишь четырех генов в дифференцированную клетку. Эта новость произвела на слушателей эффект разорвавшейся бомбы. В зале воцарилась атмосфера, подобная той, что можно увидеть в ключевых эпизодах старых фильмов, когда присяжные оглашают свой вердикт, и репортеры сломя голову бросаются к телефонам, чтобы сообщить о нем редакторам своих изданий.

Рудольф Джениш был великодушен — он охотно признал, что взялся за воспроизведение этих экспериментов, поскольку был уверен, что Яманака ошибается. То, что произошло после этого в отрасли, можно назвать настоящим переворотом. Во-первых, действительно крупные лаборатории, занимающиеся исследованиями стволовых клеток, начали изучать методику Яманаки, оттачивая и совершенствуя ее, чтобы добиться наибольшей эффективности. Через какую-то пару лет даже те лаборатории, которые прежде не вырастили ни единой ЭС клетки, вовсю занимались созданием iPS клеток из интересующих их тканей и доноров. Материалы исследований на тему iPS клеток теперь публикуются еженедельно. Эта техника модифицирована для прямого превращения человеческих фибробластов в нервные клетки человека без предварительного создания iPS клеток[11]. Это можно сравнить с тем, что мы закатываем шарик вверх до середины склона уоддингтоновского эпигенетического ландшафта, а затем запускаем его вниз по другой выемке.

Трудно не задаться вопросом, было ли для Шиньи Яманаки обидно, что никто не стал развивать его работу и пользоваться результатами исследований, пока американская лаборатория не доказала его правоту. В 2009 году он разделил Ласкеровскую премию с Джоном Гердоном, так что, возможно, он и не сильно переживает. Его репутация теперь не подлежит сомнению.

[9] For a useful review of the state of knowledge at the time see Rao, M. (2004) Dev Biol. 275: 269–86.

[10] Takahashi and Yamanaka (2006), Cell 126: 663–76.

[11] Pang et al. (2011), Nature online publication May 26.