Инфекции, передаваемые половым путем: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее кол­бы, пробирки, пипетки, предметные стекла, загрязненные антиге­ном. Готовят также почкообразный тазик, заливаемый на 2/3 дис­тиллированной водой, куда складывают покровные стекла после работы. Приготовление препарата для подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке ис­следуемого материала в препарате можно получить недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же после центрифугирования, так как при длительном стоянии пробирок (15-24 ч) возможны ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную жидкость берут микропипеткой объе­мом 0,1 мл.

Для постановки реакции используются следующие ингредиен­ты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты до­нора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при температуре 55-56°С в течение 30 мин.

В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штам­ма Никольса. Здоровым кроликам интратестикулярно вводят по 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболи­ей, вводя 20 см3 воздуха в ушную вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Пос­ле этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных трепонем. Для этого микропи-геткой из пробирки наливают 0,01 мл на предметное стекло, по­крывают покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает 100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильно­го изотонического раствора натрия хлорида и производят встряхи­вание в шюттель-аппарате в течение 50 мин. Первую порцию взвеси бледных трепонем уничтожают (она не может быть использована в качестве антигена). Вторую порцию жидкости, полученную при эк­страгировании, отсасывают стерильной пипеткой, разливают в хи­мические пробирки и снова определяют в ней число бледных трепо­нем в поле зрения. При наличии в этой порции жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями изотонического раствора натрия хло­рида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в поле зрения. После каждого экстрагирования жидкость из колбочки отсасывают пипеткой в стерильные химические про­бирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надо­садочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в те­чение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в тем­ном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изго­товления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количе­ство бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содер­жать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимо­го количества антигена делается в день постановки реакции. Напри­мер, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных по­терь).

Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроци­тов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотони­ческим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эрит­роцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроци­тов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).

Техника постановки. Предварительно для реакции разво­дят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипет­кой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энер­гично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной тем­пературе на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покров­ным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик. При этом на первой клавише (слева) учитывается число полей зрения, а на пос­ледней клавише (справа) – число трепонем в 10 полях зрения. При просмотре препарата под микроскопом учитываются только те блед­ные трепонемы, которые могут свободно перемещаться с током жидкости. Те же трепонемы, которые попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания блед­ных трепонем исчисляется по формуле:

(100 – Оn) /K х 100,

где On – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки; К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из конт­рольной пробирки.

При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0-20%, результат расценивается как отрицательный; 21-30% – как сомнительный; 31-50 % – слабоположительный и при 51-100%-как положительный. В ответе результат реакции выписывается без ука­зания процента. В случае несовпадения результатов РИП сданными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повто­рить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.

РИП следует применять в следующих случаях: при диагностике тех форм сифилиса, когда на основании данных анамнеза, клини­ки, результатов КСР и других исследований не удается подтвердить диагноз заболевания; при дифференцировании неспецифических ре­зультатов КСР; при контрольном наблюдении после окончания ле­чения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.

Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА). Принцип метода заключается в следующем: формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются с экстрак­том из патогенных бледных трепонем. Образующийся комплекс, который фиксируется на эритроцитах, составляет корпускулярный антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов. Антигеном для этой реакции являются эритроциты барана или индюка, покрытые частицами блед­ных трепонем от зараженных кроликов, а затем фрагментирован-ные ультразвуком. Адсорбирующий разбавитель (состоит из фраг­ментов эритроцитарных мембран барана либо индюка и быка, тре­понем Рейтера, ткани семенников кролика, кроличьей сыворотки) заливают в лунки пластин, куда затем вносят инактивированную сыворотку. Разбавитель связывает неспецифические групповые ан­титела. Специфические иммуноглобулины к бледным трепонемам вызывают агглютинацию. Предварительный результат может быть зарегистрирован после инкубации в течение 3-4 ч. Появление равно­мерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного цвета в виде пятна или кольца является показателем осаждения эритроцитов. ТРПГА-тест, выполняемый вручную или автоматизированным методом, являет­ся достаточно специфичным и чувствительным тестом.

Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА-ТР) является вариантом ТРПГА. Ее ставят на пластинках для мик­ротитрования. Она требует по сравнению с ТРПГА намного мень­шего количества сыворотки, адсорбирующего разбавителя и анти­гена. Окончательный результат получают уже после 4 ч инкубирования сыворотки. Автоматизированная реакция микрогемагглютина­ции с бледными трепонемами (АМНА-ТР) благодаря автоматиза­ции процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки еще проще и обходится еще дешевле, чем реакция АМН-ТР. Она особенно пригодна при массовых обследованиях на сифилис.

Клиническая оценка результатов серологических реакций.

При первичном серонегативном периоде сифилиса бывают по­ложительными РИФ и реакция Колмера как наиболее чувствительные серореакции. Однако это не является основанием для постанов­ки таким больным диагноза первичного серопозитивного сифилиса. У ряда больных в этом периоде бывает изолированный положитель­ный результат при постановке реакции Вассермана с трепонемны-ми или с кардиолипиновым антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся поло­жительными стандартные серологические реакции – с этого мо­мента начинается первичный серопозитивный период сифилиса. На 1-2-й неделе первичного серопозитивного сифилиса отмечается уве­личение степени позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарас­тание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера уже у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ, как правило, отрицательная или процент иммобилизации очень низок. Диагноз первичного серопозитивного сифилиса ставится и тем боль­ным, у которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспе­цифическими антигенами дали даже однократный слабоположитель­ный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции становятся резко положительными (4+); титр реагинов достигает 1:80, 1:160, РИФ продолжает быть резко положительной, но РИБТ у большинства больных еще остается отрицательной или может стать слабоположительной.

При вторичном свежем сифилисе резко положительный резуль­тат по всем стандартным серологическим реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок – 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ – 4+; РИБТ дает положительнй результат более чем у половины больных, однако процент иммобилизации трепо-нем невысок (40-60%).

При вторичном рецидивном сифилисе положительный результат по стандартным серологическим реакциям отмечается в 96-98% на­блюдений. Отрицательные результаты могут иногда объясняться малосимптомным рецидивным течением, наличием астенизации и со­четанием сифилиса и ВИЧ-инфекции. РИБТ дает положительный результат у 85-90% больных при выраженной степени иммобилиза­ции – 80-90-100%.

Третичный сифилис характеризуется положительными резуль­татами по стандартным серологическим реакциям в 50-90% наблю­дений и положительной РИБТ у 92-100% пациентов с высоким процентом иммобилизации.

Диагноз скрытого серопозитивного сифилиса, как указывалось выше, устанавливают только по положительным серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, так как только РИБТ (и в меньшей степени РИФ) позволяет отдифференцировать ложноположительные серореакции (даже с позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.

Разные формы сифилиса нервной системы и висцерального си­филиса имеют различную частоту и выразительность стандартных серореакции. Так, прогрессивный паралич в 100% случаев сопро­вождается резко положительными всеми стандартными серологи­ческими реакциями. Сифилис сосудов мозга, спинная сухотка, си­филитическое поражение сердечно-сосудистой системы сопровож­даются положительными серореакциями лишь в 40-50-60% наблю­дений. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологичес­ких состояниях дает резко положительный результат (90-100% им­мобилизации).

При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес после рождения стандартные серологические реакции у ребенка не определяют, т. к. они могут быть положительными за счет пассив­ной передачи реагинов через плаценту. По этой же причине не име­ет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно передан­ные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес после рождения. Если ребенок инфицируется неза­долго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной (в связи с более поздним образованием иммобилизинов), несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.

При врожденном сифилисе детей грудного возраста с активны­ми проявлениями стандартные серореакции могут быть отрицатель­ными в 1% наблюдений.

При врожденном сифилисе раннего детского возраста отрица­тельные стандартные серореакции варьируют от 15 до 20%, но в этих случаях РИБТ дает положительные данные у 90-98% детей.

При позднем врожденном сифилисе даже при наличии активных проявлений стандартные серореакции констатируются лишь у 70-80% обследованных, но зато РИБТ четко положительная у 100% больных с высоким титром иммобилизинов.

Современные усовершенствованные серореакции с использованием принципов иммуноферментных констант.

Несмотря на значительное количество тестов для серодиагнос­тики сифилиса, их высокую чувствительность и специфичность имеется ряд состояний при которых данные серодиагностики требу­ют проверки и дополнительных исследований. Например, у пациен­тов, полноценно леченных по поводу сифилиса, иногда длительное время остаются положительными серореакции. Это объясняется со­стоянием серорезистентности, которое до настоящего времени не получило научной трактовки. Затрудняется также дифференциаль­ная диагностика неведомого сифилиса от рецидива процесса и реинфекции. С целью разработки более информативных вариантов се­рореакции были использованы детали антителообразования у боль­ных сифилисом, с предложением и исследованием следующих ва­риантов серореакции: метод иммуноферментного анализа (ИФА), метод иммуноблоттинга (IgM-серология), полимеразная цепная ре­акция (ПЦР).

Иммуноферментный анализ.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА, The enzymelinked immunosorbent Assay, Elisa) широко используется для диагностики сифилиса. Принцип реакции заключается в соединении сифилити­ческого антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с антителом испытуемой сыворотки крови и выявления специфического комплекса антиген – антитело с помощью анти­видовой иммунной сыворотки, меченной ферментом. Взаимодей­ствие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

В нашей стране методика постановки ИФА для серодиагностики сифилиса с отечественными ингредиентами разработана в отделе микробиологии ЦНИКВИ. При исследовании 1609 образцов сыво­ротки крови и спинномозговой жидкости выявлена чувствитель­ность, составившая 95,2%, и высокая специфичность. Отрицатель­ные результаты ИФА у полноценно леченных больных сифилисом могут служить критерием излечения (Дмитриев Г.А.). При автомати­зированном учете результатов эта реакция используется для профи­лактического освидетельствования на сифилис больших групп об­следуемых: доноров, беременных и др.

Тест для выявления IgG (Captia Syphilis G test) – тест-ловушка использует в качестве антигена очищенные патогенные трепонемы. У больных с вторичным, ранним и поздним сифилисом и нейроси-филисом и у реинфицированных пациентов чувствительность теста 100%. Тот же принцип ловушки для антител применен с целью определения сывороточных IgM (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е.).

Метод иммуноблоттинга.